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摘要[目的]优化根瘤农杆菌产琥珀酰多糖的发酵培养条件。[方法]通过单因素试验和正交试验优化根瘤农杆菌产琥珀酰多糖的发酵培养条件。[结果]最终得到的优化培养条件为：蔗糖70 g/L，酵母粉6 g/L，CaCO3 10 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.025 g/L，发酵时间4 d，种子接种量2.5%，培养基初始pH 7.2，发酵温度30 ℃，摇瓶转速250 r/min。在上述最优方案下，根瘤农杆菌琥珀酰多糖产量达18.550 g/L，比其初始条件下产量（8.010 g/L）明显提高。[结论]该研究为利用根瘤农杆菌生产琥珀酰多糖提供了理论依据。
关键词根瘤农杆菌；琥珀酰多糖；发酵
中图分类号S182文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）26-0015-03
Optimization of Fermentation Conditions for Succinoglucan Production by Agrobacterium tumefacien
ZHENG Suya，YI Yi，WANG Jinxia，GAO Hongliang* et al（School of Life Sciences，East China Normal University，Shanghai 200241）
Abstract[Objective] The aim was to optimize the fermentation conditions for succinoglucan production by Agrobacterium tumefacien.[Method] We optimized the fermentation conditions for succinoglucan production by Agrobacterium tumefacien through orthogonal experiment and singlefactor test.[Result] The optimal medium consisted of 70 g/L sucrose，6 g/L yeast extract，10 g/L CaCO3，1.5 g/L MgSO4 and 0.025 g/L KH2PO4，and the optimal fermentation conditions included the incubation time of 4 d，inoculum amount of 2.5%，initial pH of 7.2，culture temperature of 30 ℃ and shaking speed of 250 r/min.Under these conditions，the yield of succinoglucan from Agrobacterium tumefacien was obviously improved to 18.550 g/L，compared with the initial 8.010 g/L.[Conclusion] The study can provide reliable basis for utilizing this Agrobacterium strain to make a further research into succinoglucan and to potentially produce succinoglucan in an industrial scale.
Key wordsAgrobacterium tumefacien；Succinoglucan；Fermentation
根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性土壤杆菌[1]，属于α-变形菌纲根瘤菌科农杆菌属，是一种普遍存在的土壤微生物[2]。除了其在基因工程领域的广泛应用外，早在1999年就有报道说明利用根瘤农杆菌发酵提取琥珀酰多糖[3]。琥珀酰多糖由D-半乳糖、D-葡萄糖（1∶7）八糖重复单元构成，含β-1，3、β-1，4、β-1，6糖苷键，是一类酸性的可溶性胞外多糖[4-5]。经过自然发酵产生的或化学修饰的琥珀酰多糖具有在高温、高压、极端pH或高剪切作用下表现出高稳定性的特性[6]，并且琥珀酰多糖具有很高的可溶性和黏性等特性，其可以作为增稠剂、稳定剂、乳化剂等在食品[6]、医药[7]、化妆品[8-9]等领域广泛应用。
据报道，琥珀酰多糖可以由根瘤菌属、土壤杆菌属、产碱杆菌属、假单胞菌属等属的细菌产生，土壤农杆菌属（Agrobacterium）菌株被认为最具有工业化潜力[3]，其中根瘤农杆菌有关遗传与代谢方面的研究较多[2，10-11]。但目前关于利用根瘤农杆菌生产琥珀酰多糖的研究多集中于多糖结构性质[5，12-14]与菌体代谢机制[15-16]方面，而对其发酵生产仅有Stredansky等[17]分别进行了培养基优化、相关性探究[18]和分批补料研究[3]。鉴于此，笔者对根瘤农杆菌AT01发酵生产琥珀酰多糖的发酵条件进行了优化，以提高其产量，为其进一步工业化生产奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种。
根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）AT01，由华东师范大学生命科学学院微生物与发酵实验室保存。
1.1.2主要仪器。
sigma 2-16KL冷冻离心机为Sartorius公司产品；QUintix型電子天平（精密度0.1 mg）为Sartorius公司产品；SZ-CR21N型日立离心机为HITACHI公司产品；ZQZY-BF型全温恒温培养摇床为上海知楚仪器有限公司产品。 1.1.3培养基。
斜面培养基：葡萄糖 10 g/L，牛肉膏 3 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，玉米浆 1.5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0。种子培养基：蔗糖 20 g/L，酵母粉A802 5 g/L，蛋白胨5 g/L，pH 7.0。基础发酵培养基：蔗糖 50 g/L，酵母粉A902 5 g/L，CaCO3 10 g/L，pH 7.2。
1.2方法
1.2.1种子培养。挑取1环斜面种子接入装有50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃、250 r/min摇床培养16 h。
1.2.2摇瓶发酵。以5%接种量将种子液接入裝有50 mL培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃、250 r/min摇床培养96 h。
1.2.3测定方法。
1.2.3.1发酵液的预处理。
称取5 mL发酵液，加入20 mL蒸馏水稀释，室温12 000 r/min离心20 min，分离上清液和沉淀备用。
1.2.3.2琥珀酰多糖的测定。
取预处理后的发酵液上清于50 mL离心管中，加入2倍体积的95%乙醇沉淀多糖，9 000 r/min离心10 min，重复2次，取沉淀于培养皿上，在80 ℃烘箱中过夜烘干，称重，测定多糖含量。
1.2.3.3生物量的测定。
取预处理后的50 mL发酵液的沉淀，加入20 mL 1 mol/L盐酸溶液并搅拌，12 000 r/min离心10 min，加入20 mL蒸馏水洗涤菌体沉淀2次，取沉淀在锡纸上60 ℃过夜烘干，称重，测生物量。
1.2.4单因素试验。
1.2.4.1蔗糖浓度的初步确定。
把质量浓度为10、30、50、70、90 g/L的蔗糖添加到基础发酵培养基中，按照“1.2.2”方法发酵后，检测多糖产量。
1.2.4.2不同种类酵母粉对琥珀酰多糖产量的影响。选取A802、A902、A408、A803以及Sangon多种酵母粉按照5 g/L的浓度添加到基础发酵培养基中，按照“1.2.2”方法发酵后，检测多糖产量。
1.2.4.3接种量对多糖产量的影响。对基础发酵培养基分别接入1.0%、2.5%、5.0%、7.5%和10.0%种子液，按照“1.2.2”方法发酵后，检测多糖产量。
1.2.4.4无机盐对琥珀酰多糖产量的影响。
在基础发酵培养基中添加不同浓度的NaCl或者KH2PO4或者MgSO4·7H2O后，按照“1.2.2”方法发酵后，检测多糖产量和其他相关参数。
1.2.5正交试验。
通过单因素试验，发现对根瘤农杆菌产琥珀酰多糖影响较显著的4个因素分别为蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4·7H2O，选取该4个因素作为正交试验因子，以最适宜条件为参考，设置3个水平（表1），进行L9（34）正交试验。
1.3数据统计所有试验做3个平行，利用Excel和SPSS软件对试验结果进行分析。
2结果与分析
2.1单因素试验初步确定发酵条件
2.1.1蔗糖浓度对琥珀酰多糖产量的影响。
由图1可知，随着蔗糖浓度的增加，琥珀酰多糖产量不断提高。当蔗糖浓度为50 g/L时，琥珀酰多糖产量为8.01 g/L；当蔗糖浓度为70 g/L时，琥珀酰多糖产量达到最高值，为9.60 g/L，之后随着蔗糖浓度上升，琥珀酰多糖产量开始有所下降。这可能是当蔗糖浓度超过70 g/L时，菌体繁殖旺盛，导致发酵液中菌体浓度过高，对发酵过程中氧的消耗增加，限制了菌体产糖过程[19]。
2.1.2不同种类酵母粉对琥珀酰多糖产量的影响。
由图2可知，不同种类酵母粉对琥珀酰多糖产量的影响很大，即使同为A公司产品的不同种类酵母粉差异也很大。其中，使用A802酵母粉组分的终产量达14.97 g/L，Sangon的酵母粉组分产量达15.16 g/L，二者远高于其他种类氮源添加组分中琥珀酰多糖产量。综合产量和经济因素，最终确定最佳酵母粉种类为A802，后续试验酵母粉均使用A802。
2.1.3接种量对琥珀酰多糖产量的影响。
由图3可知，接种量为1.0%、2.5%和5.0%时，琥珀酰多糖产量最高，分别为15.11、15.79和14.26 g/L，差异不显著。之后增大接种量，琥珀酰多糖产量反而有所下降，这是因为过高的接种量造成基质缺乏，生长过快，进而影响产物合成[20]。因此，应控制接种量在1.0%～5.0%，该试验确定接种量为2.5%。
2.1.4无机盐对琥珀酰多糖产量的影响。
文献报道一些无机盐也会对琥珀酰多糖的产量造成影响，如KH2PO4、NaCl、MgSO4等[14]。
2.1.4.1KH2PO4对琥珀酰多糖产量的影响。
由图4可知，添加不同浓度的KH2PO4对琥珀酰多糖的产量有一定影响。随着KH2PO4浓度的增加，多糖产量逐渐增加，当KH2PO4浓度为0.050 g/L时，多糖产量达到最大，为17.71 g/L。当KH2PO4浓度大于0.050 g/L时，随着质量浓度的升高产量逐渐下降。因此，选取0.050 g/L KH2PO4进行后续试验。
2.1.4.2NaCl对琥珀酰多糖产量的影响。
由图5可知，随着NaCl浓度的增加，琥珀酰多糖产量与无添加NaCl的对照相比逐渐减少。在微生物细胞中，Na+与K+一般互为拮抗作用，共同存在，维持渗透压环境的稳定，只添加NaCl可能会打破细胞本身的渗透压平衡，不利于琥珀酰多糖的合成。
2.1.4.3MgSO4对琥珀酰多糖产量的影响。 由圖6可知，琥珀酰多糖产量随着MgSO4浓度的增加而逐渐增加，MgSO4添加量在1.5 g/L时达到最大值，为16.49 g/L，随后琥珀酰多糖产量随着MgSO4浓度的增加略有下降。镁是许多重要酶的激活剂和启动器，所以其用量的选择也非常关键[21]。因此，选取1.5 g/L MgSO4进行后续试验。
2.2正交试验确定产琥珀酰多糖的最优培养条件单因素试验优化结果表明，对根瘤农杆菌产琥珀酰多糖影响较为显著的4个因素分别为蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4，选取这4个因素进行正交试验。
由表2可知，根据极差（R）得出各因素对琥珀酰多糖产量影响从大到小顺序为C、A、D、B，即KH2PO4、蔗糖、MgSO4、酵母粉，综合响应的琥珀酰多糖产量数据，得出4个因素的最佳组合是A2B3C1D2，即蔗糖70 g/L，酵母粉6 g/L，KH2PO4 0.025 g/L，MgSO4 1.5 g/L。按照该最优条件进行3次验证试验，得到琥珀酰多糖产量的平均值为18.550 g/L，是基础培养基产量（8.010 g/L）的2.32倍，显著提高了根瘤农杆菌AT01的琥珀酰多糖产量。
3结论
通过单因素试验，从培养基主要组成探讨了根瘤农杆菌产琥珀酰多糖的最佳条件，在此基础上选择对琥珀酰多糖产量影响较为显著的蔗糖浓度、酵母粉浓度、KH2PO4浓度和MgSO4浓度进行L9（34）正交试验。最终得到的最优化培养条件为：蔗糖70 g/L，酵母粉6 g/L，CaCO3 10 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.025 g/L，发酵时间4 d，菌液接种量2.5%，培养基初始pH 7.2，发酵温度30 ℃，摇瓶转速250 r/min。在该最优方案下，根瘤农杆菌AT01琥珀酰多糖的产量达18.550 g/L。该结果为今后琥珀酰多糖的进一步研究奠定了基础。
参考文献
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安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（26）：21-22，40
关键词根瘤农杆菌；琥珀酰多糖；发酵
中图分类号S182文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）26-0015-03
Optimization of Fermentation Conditions for Succinoglucan Production by Agrobacterium tumefacien
ZHENG Suya，YI Yi，WANG Jinxia，GAO Hongliang* et al（School of Life Sciences，East China Normal University，Shanghai 200241）
Abstract[Objective] The aim was to optimize the fermentation conditions for succinoglucan production by Agrobacterium tumefacien.[Method] We optimized the fermentation conditions for succinoglucan production by Agrobacterium tumefacien through orthogonal experiment and singlefactor test.[Result] The optimal medium consisted of 70 g/L sucrose，6 g/L yeast extract，10 g/L CaCO3，1.5 g/L MgSO4 and 0.025 g/L KH2PO4，and the optimal fermentation conditions included the incubation time of 4 d，inoculum amount of 2.5%，initial pH of 7.2，culture temperature of 30 ℃ and shaking speed of 250 r/min.Under these conditions，the yield of succinoglucan from Agrobacterium tumefacien was obviously improved to 18.550 g/L，compared with the initial 8.010 g/L.[Conclusion] The study can provide reliable basis for utilizing this Agrobacterium strain to make a further research into succinoglucan and to potentially produce succinoglucan in an industrial scale.
Key wordsAgrobacterium tumefacien；Succinoglucan；Fermentation
根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性土壤杆菌[1]，属于α-变形菌纲根瘤菌科农杆菌属，是一种普遍存在的土壤微生物[2]。除了其在基因工程领域的广泛应用外，早在1999年就有报道说明利用根瘤农杆菌发酵提取琥珀酰多糖[3]。琥珀酰多糖由D-半乳糖、D-葡萄糖（1∶7）八糖重复单元构成，含β-1，3、β-1，4、β-1，6糖苷键，是一类酸性的可溶性胞外多糖[4-5]。经过自然发酵产生的或化学修饰的琥珀酰多糖具有在高温、高压、极端pH或高剪切作用下表现出高稳定性的特性[6]，并且琥珀酰多糖具有很高的可溶性和黏性等特性，其可以作为增稠剂、稳定剂、乳化剂等在食品[6]、医药[7]、化妆品[8-9]等领域广泛应用。
据报道，琥珀酰多糖可以由根瘤菌属、土壤杆菌属、产碱杆菌属、假单胞菌属等属的细菌产生，土壤农杆菌属（Agrobacterium）菌株被认为最具有工业化潜力[3]，其中根瘤农杆菌有关遗传与代谢方面的研究较多[2，10-11]。但目前关于利用根瘤农杆菌生产琥珀酰多糖的研究多集中于多糖结构性质[5，12-14]与菌体代谢机制[15-16]方面，而对其发酵生产仅有Stredansky等[17]分别进行了培养基优化、相关性探究[18]和分批补料研究[3]。鉴于此，笔者对根瘤农杆菌AT01发酵生产琥珀酰多糖的发酵条件进行了优化，以提高其产量，为其进一步工业化生产奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种。
根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）AT01，由华东师范大学生命科学学院微生物与发酵实验室保存。
1.1.2主要仪器。
sigma 2-16KL冷冻离心机为Sartorius公司产品；QUintix型電子天平（精密度0.1 mg）为Sartorius公司产品；SZ-CR21N型日立离心机为HITACHI公司产品；ZQZY-BF型全温恒温培养摇床为上海知楚仪器有限公司产品。 1.1.3培养基。
斜面培养基：葡萄糖 10 g/L，牛肉膏 3 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，玉米浆 1.5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.0。种子培养基：蔗糖 20 g/L，酵母粉A802 5 g/L，蛋白胨5 g/L，pH 7.0。基础发酵培养基：蔗糖 50 g/L，酵母粉A902 5 g/L，CaCO3 10 g/L，pH 7.2。
1.2方法
1.2.1种子培养。挑取1环斜面种子接入装有50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃、250 r/min摇床培养16 h。
1.2.2摇瓶发酵。以5%接种量将种子液接入裝有50 mL培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃、250 r/min摇床培养96 h。
1.2.3测定方法。
1.2.3.1发酵液的预处理。
称取5 mL发酵液，加入20 mL蒸馏水稀释，室温12 000 r/min离心20 min，分离上清液和沉淀备用。
1.2.3.2琥珀酰多糖的测定。
取预处理后的发酵液上清于50 mL离心管中，加入2倍体积的95%乙醇沉淀多糖，9 000 r/min离心10 min，重复2次，取沉淀于培养皿上，在80 ℃烘箱中过夜烘干，称重，测定多糖含量。
1.2.3.3生物量的测定。
取预处理后的50 mL发酵液的沉淀，加入20 mL 1 mol/L盐酸溶液并搅拌，12 000 r/min离心10 min，加入20 mL蒸馏水洗涤菌体沉淀2次，取沉淀在锡纸上60 ℃过夜烘干，称重，测生物量。
1.2.4单因素试验。
1.2.4.1蔗糖浓度的初步确定。
把质量浓度为10、30、50、70、90 g/L的蔗糖添加到基础发酵培养基中，按照“1.2.2”方法发酵后，检测多糖产量。
1.2.4.2不同种类酵母粉对琥珀酰多糖产量的影响。选取A802、A902、A408、A803以及Sangon多种酵母粉按照5 g/L的浓度添加到基础发酵培养基中，按照“1.2.2”方法发酵后，检测多糖产量。
1.2.4.3接种量对多糖产量的影响。对基础发酵培养基分别接入1.0%、2.5%、5.0%、7.5%和10.0%种子液，按照“1.2.2”方法发酵后，检测多糖产量。
1.2.4.4无机盐对琥珀酰多糖产量的影响。
在基础发酵培养基中添加不同浓度的NaCl或者KH2PO4或者MgSO4·7H2O后，按照“1.2.2”方法发酵后，检测多糖产量和其他相关参数。
1.2.5正交试验。
通过单因素试验，发现对根瘤农杆菌产琥珀酰多糖影响较显著的4个因素分别为蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4·7H2O，选取该4个因素作为正交试验因子，以最适宜条件为参考，设置3个水平（表1），进行L9（34）正交试验。
1.3数据统计所有试验做3个平行，利用Excel和SPSS软件对试验结果进行分析。
2结果与分析
2.1单因素试验初步确定发酵条件
2.1.1蔗糖浓度对琥珀酰多糖产量的影响。
由图1可知，随着蔗糖浓度的增加，琥珀酰多糖产量不断提高。当蔗糖浓度为50 g/L时，琥珀酰多糖产量为8.01 g/L；当蔗糖浓度为70 g/L时，琥珀酰多糖产量达到最高值，为9.60 g/L，之后随着蔗糖浓度上升，琥珀酰多糖产量开始有所下降。这可能是当蔗糖浓度超过70 g/L时，菌体繁殖旺盛，导致发酵液中菌体浓度过高，对发酵过程中氧的消耗增加，限制了菌体产糖过程[19]。
2.1.2不同种类酵母粉对琥珀酰多糖产量的影响。
由图2可知，不同种类酵母粉对琥珀酰多糖产量的影响很大，即使同为A公司产品的不同种类酵母粉差异也很大。其中，使用A802酵母粉组分的终产量达14.97 g/L，Sangon的酵母粉组分产量达15.16 g/L，二者远高于其他种类氮源添加组分中琥珀酰多糖产量。综合产量和经济因素，最终确定最佳酵母粉种类为A802，后续试验酵母粉均使用A802。
2.1.3接种量对琥珀酰多糖产量的影响。
由图3可知，接种量为1.0%、2.5%和5.0%时，琥珀酰多糖产量最高，分别为15.11、15.79和14.26 g/L，差异不显著。之后增大接种量，琥珀酰多糖产量反而有所下降，这是因为过高的接种量造成基质缺乏，生长过快，进而影响产物合成[20]。因此，应控制接种量在1.0%～5.0%，该试验确定接种量为2.5%。
2.1.4无机盐对琥珀酰多糖产量的影响。
文献报道一些无机盐也会对琥珀酰多糖的产量造成影响，如KH2PO4、NaCl、MgSO4等[14]。
2.1.4.1KH2PO4对琥珀酰多糖产量的影响。
由图4可知，添加不同浓度的KH2PO4对琥珀酰多糖的产量有一定影响。随着KH2PO4浓度的增加，多糖产量逐渐增加，当KH2PO4浓度为0.050 g/L时，多糖产量达到最大，为17.71 g/L。当KH2PO4浓度大于0.050 g/L时，随着质量浓度的升高产量逐渐下降。因此，选取0.050 g/L KH2PO4进行后续试验。
2.1.4.2NaCl对琥珀酰多糖产量的影响。
由图5可知，随着NaCl浓度的增加，琥珀酰多糖产量与无添加NaCl的对照相比逐渐减少。在微生物细胞中，Na+与K+一般互为拮抗作用，共同存在，维持渗透压环境的稳定，只添加NaCl可能会打破细胞本身的渗透压平衡，不利于琥珀酰多糖的合成。
2.1.4.3MgSO4对琥珀酰多糖产量的影响。 由圖6可知，琥珀酰多糖产量随着MgSO4浓度的增加而逐渐增加，MgSO4添加量在1.5 g/L时达到最大值，为16.49 g/L，随后琥珀酰多糖产量随着MgSO4浓度的增加略有下降。镁是许多重要酶的激活剂和启动器，所以其用量的选择也非常关键[21]。因此，选取1.5 g/L MgSO4进行后续试验。
2.2正交试验确定产琥珀酰多糖的最优培养条件单因素试验优化结果表明，对根瘤农杆菌产琥珀酰多糖影响较为显著的4个因素分别为蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4，选取这4个因素进行正交试验。
由表2可知，根据极差（R）得出各因素对琥珀酰多糖产量影响从大到小顺序为C、A、D、B，即KH2PO4、蔗糖、MgSO4、酵母粉，综合响应的琥珀酰多糖产量数据，得出4个因素的最佳组合是A2B3C1D2，即蔗糖70 g/L，酵母粉6 g/L，KH2PO4 0.025 g/L，MgSO4 1.5 g/L。按照该最优条件进行3次验证试验，得到琥珀酰多糖产量的平均值为18.550 g/L，是基础培养基产量（8.010 g/L）的2.32倍，显著提高了根瘤农杆菌AT01的琥珀酰多糖产量。
3结论
通过单因素试验，从培养基主要组成探讨了根瘤农杆菌产琥珀酰多糖的最佳条件，在此基础上选择对琥珀酰多糖产量影响较为显著的蔗糖浓度、酵母粉浓度、KH2PO4浓度和MgSO4浓度进行L9（34）正交试验。最终得到的最优化培养条件为：蔗糖70 g/L，酵母粉6 g/L，CaCO3 10 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.025 g/L，发酵时间4 d，菌液接种量2.5%，培养基初始pH 7.2，发酵温度30 ℃，摇瓶转速250 r/min。在该最优方案下，根瘤农杆菌AT01琥珀酰多糖的产量达18.550 g/L。该结果为今后琥珀酰多糖的进一步研究奠定了基础。
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