【摘 要】
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目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法①选择GATA1基因为目的基因，利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体(重组臂)，并且以电穿孔的方式将共表达载体、打靶载体及环化重组酶(Cre)导入hPSC的H1细胞系。经电穿孔后的H1细胞培养2d后，选择24个H1细胞单克隆进行PCR扩增，以验证共表达载体和打靶载体是否被成功
【机 构】
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中国医学科学院输血研究所，成都 610052中国医学科学院输血研究所，成都 610052中国医学科学院输血研究所，成都 610052中国医学科学院输血研究所，成都 610052中国医学科学院输血研究所
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目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。
方法①选择GATA1基因为目的基因，利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体(重组臂)，并且以电穿孔的方式将共表达载体、打靶载体及环化重组酶(Cre)导入hPSC的H1细胞系。经电穿孔后的H1细胞培养2 d后，选择24个H1细胞单克隆进行PCR扩增，以验证共表达载体和打靶载体是否被成功导入，以及Cre是否成功去除H1细胞单克隆中的筛选标志物。②挑取经PCR验证的条带大小正确的阳性H1细胞单克隆，进行细胞培养后，提取H1细胞单克隆基因组，并且分别采用引物对1/2(GATA1 5′端臂外引物/mCherry 3′端引物)和3/5(HygroR 5′端引物/GATA1 3′端臂外引物)对基因组进行PCR扩增，以验证该H1细胞单克隆是否具有GATA1和mCherry正确序列。③使用构建完成的H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血功能验证实验，以确认基因编辑是否改变H1细胞特性，以及造血分化能力。选择未经基因编辑H1细胞和H1∶GATA1-mCherry细胞，置于相同的造血分化培养条件培养14 d后，分别于610 nm激发波长免疫荧光显微镜下观察，并采用流式细胞术(FCM)对细胞表面标志物CD34、CD43、CD45进行检测。选取培养至GATA1大量表达时期的H1∶GATA1-mCherry细胞，进行细胞甩片和免疫荧光染色实验。对经过基因编辑的H1∶GATA1-mCherry细胞，进行GATA1特异抗体染色体，观察其能否准确追踪并指示GATA1。
结果①经电穿孔转入打靶载体和共表达载体后，H1细胞单克隆PCR扩增产物的电泳结果显示，H1细胞经电穿孔后，可获得2 710和945 bp的PCR扩增产物电泳条带；电泳条带为2 710 bp，说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列，但是Cre没有去除筛选标志物；条带大小为945 bp，说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列，并且Cre已去除筛选标志物，为目的H1细胞。选取24个H1细胞单克隆进行PCR验证结果显示，打靶载体和共表达载体成功敲入的H1细胞克隆、打靶载体和共表达载体成功敲入且Cre去除筛选标志的H1细胞克隆(目的细胞)及染色体纯合敲入的H1细胞比例分别为80%(20/24)、50%(10/20)和90%(18/20)。②H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血诱导培养14 d时，荧光显微镜下GATA1表达时期可见大量红色荧光，FCM检测结果显示，未经基因编辑H1细胞与H1∶GATA1-mCherry细胞相比，造血干/祖细胞群比例相似，二者CD34 CD45 细胞比例分别为12.4%和14.1%，CD34 CD45 细胞比例分别为17.0%和20.2%，表明H1∶GATA1-mCherry细胞的造血分化能力没有改变。③ GATA1高表达时期H1∶GATA1-mCherry细胞的免疫荧光染色实验结果显示，荧光显微镜下可见仅GATA1抗体染色阳性细胞有mCherry标志物，表明H1∶GATA1-mCherry细胞通过mCherry荧光蛋白对GATA1基因的标记是准确且特异的。
结论本研究以GATA1为目的基因，在hPSC中快速、高效进行基因敲入，成功建立快速、实时示踪目的基因表达的方法。
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