目的 探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性.方法 构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成.AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导.该载体同时含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,用作检测细胞增殖的标记.应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞.转导后的CD34+细胞在SCF、FL、TPO、IL-6细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组.定期检测CD34+细胞基因转移后GFP动态变化、细胞免疫标记、造血祖细胞集落培养和裸鼠致瘤试验.结果 分选的CD34+细胞纯度为91%以上,基因转移率为49.3%±6.2%;实验组AP20187+SCF+FL+TPO+IL-6(ASFTI)与对照组SCF+FL+TPO+IL-6(SFTI)组均可获得CD34+细胞大量扩增.随着培养时间的延长,实验组扩增的CD34+细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上,而对照组GFP阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失.在培养6周左右,实验组CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞亚群扩增倍数分别为(228.26±32.31)、(321.48±40.52),分别与对照组相比,差异有显著性.ASFTI组转基因CD34+细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落(BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix).扩增后CD34+细胞检测染色体核型正常,裸鼠实验无致瘤特性.结论 转染JAK2基因的人脐血CD34+细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值。
靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控的实验研究
【摘 要】
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目的 探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性.方法 构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成.AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导.该载体同时含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,用作检测细胞增殖的标记.应用MiniMAC
【机 构】
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100730,中国协和医科大学研究生院，卫生部北京医院血液科,卫生部临床检验中心,卫生部北京医院血液科,卫生部北京医院血液科
【出 处】
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国际输血及血液学杂志
【发表日期】
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2006年29期
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