探讨腺苷激酶(ADK)小干扰RNA(siRNA)修饰的角膜内皮细胞诱导调节性T细胞(Treg)增生和分泌的作用。
方法取第3～5代人角膜内皮细胞，实验分为转染组和未转染组，转染组采用Lipofectamine® 3000将FAM-ADK siRNA转染进入角膜内皮细胞，采用高效液相色谱法检测各组中腺苷的质量浓度。实验分为对照组[转染对照siRNA]、雷帕霉素组(转染对照siRNA后培养液中加入10 ng/ml雷帕霉素)和ADK siRNA组(转染ADK siRNA后培养液中加入10 ng/ml雷帕霉素)，采用TUNEL染色检测细胞凋亡比例；采用流式细胞术检测内皮细胞表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和E-选择素的表达。实验分为单独培养组(单纯淋巴细胞培养)、共培养组(淋巴细胞与角膜内皮细胞共培养)和ADK siRNA组(淋巴细胞与ADK siRNA转染的角膜内皮细胞共培养)，流式细胞术检测各组CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞的比例；ELISA法检测各组上清液中白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)的质量浓度。
结果流式细胞术检测结果显示，95.1%的角膜内皮细胞表达siRNA，转染组上清液中腺苷的质量浓度为(38.020±6.658)ng/ml，较对照组的(1.663±0.581)ng/ml明显升高，差异有统计学意义(t＝5.437，P＝0.006)。TUNEL染色结果显示，雷帕霉素组角膜内皮细胞平均凋亡率较对照组明显升高，ADK siRNA组角膜内皮细胞平均凋亡率较雷帕霉素组明显降低，差异均有统计学意义(t＝3.763，P＝0.020；t＝4.405，P＝0.012)。流式细胞术检测结果显示，ADK siRNA组ICAM-1、VCAM-1和E-选择素的平均荧光强度分别为4.060±1.179、3.600±1.234和5.223±1.734，明显弱于对照组的11.600±2.427、11.030±2.291和24.270±4.332，差异均有统计学意义(t＝2.794，P＝0.049；t＝2.857，P＝0.046；t＝4.081，P＝0.015)。单独培养组、共培养组和ADK siRNA组淋巴细胞中Treg细胞比例总体比较，差异有统计学意义(F＝12.890，P＝0.007)，其中ADK siRNA组淋巴细胞中Treg细胞的比例较共培养组明显升高，差异有统计学意义(t＝3.650，P＝0.022)。ELISA检测结果显示，单独培养组、共培养组和ADK siRNA组淋巴细胞上清液中IL-10和TGF-β的质量浓度总体比较，差异均有统计学意义(F＝20.960，P＝0.003；F＝27.320，P＝0.001)，其中ADK siRNA组淋巴细胞上清液中IL-10和TGF-β的质量浓度均较共培养组明显升高，差异均有统计学意义(t＝4.492，P＝0.011；t＝5.280，P＝0.006)。
结论ADK siRNA修饰的角膜内皮细胞能够诱导Treg细胞增生及分泌IL-10和TGF-β，为角膜移植的免疫耐受诱导提供了新的选择。