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摘要：目的研究艾灸对D-半乳糖所致衰老大鼠脑组织抗氧化能力的影响。方法雄性SD大鼠采用D-半乳糖皮下注射制备亚急性衰老大鼠模型，随机数字表法分为模型组、艾灸组、吡拉西坦组，每组保证10只，设置正常组10只作为对照。分光光度法检测大鼠脑组织SOD活性、MDA水平的变化。结果与正常组相比，模型组大鼠脑组织SOD活性降低，MDA水平升高。与模型组相比，艾灸组大鼠脑组织SOD活性升高，MDA水平下降。结论艾灸可通过增强衰老大鼠脑组织抗氧化能力，达到延缓衰老的目的。
关键词：艾灸;衰老;脑组织;免疫功能;抗氧化能力;益气活血法
中图分类号：R2855 文献标志码：B 文章编号：1007-2349（2018）05-0077-03
Effect of Qi-invigorating and Blood-activating Moxibustion Therapy on Anti-oxidative
Competence of Brain in D-galactose-induced Aging Rats
GUO Tai-hu1，MO Ming-xian1，ZHAO Chang-jin1，PAN Wen-rui1，ZHANG Yong1，TANG Zhong-sheng2（1 Class 2 of Traditional Chinese Medicine of 2014，Guiyang University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China;2 Department of Anatomy，Guiyang University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China）
【Abstract】Objective：To study the effect of moxibustion on the anti-oxidative capacity of brain tissue in D-galactose-induced aging rats Methods：Male SD rats were subcutaneously injected with D-galactose to establish the subacute aging rat models The 40 rats were randomly divided into the D-galactose injection group（n=10），the D-galactose injection with moxibustion group（n=10），the D-galactose injection with piracetam group（n=10）and the untreated group as control（n=10）following the random number table The spectrophotometry was applied to detect the changes of SOD activity and MDA level in the rat brains Results：Diminished SOD activity and elevated MDA level in the rat brains were shown with injection of D-galactose in contrast to the baseline in the untreated group，as moxibustion treatment was able to reverse the changes of SOD activity and MDA level Conclusion：Moxibustion therapy can attenuate the aging process by increasing anti-oxidative capacity in rat brains
【Key words】moxibustion，aging，brain tissue，immune function，anti-oxidative competence
衰老是指伴随着年龄增长而产生的一系列生理和解剖学方面的变化，也是人体对内环境和外环境适应能力逐渐减退的表现，是生物体在生命后期阶段出现的全身性、进行性、多因素共同作用的循序渐进的退化过程，是生命过程的必然规律[1]。最近有学者认为，衰老不仅会增加机体患病几率，衰老本身也可造成器官功能衰竭，甚至死亡，可以将衰老看成一类疾病。有研究表明，氧化应激、氧化损伤的积累和抗氧化能力下降导致衰老发生[1～2]。艾灸作为针灸学特殊疗法之一，通过温热刺激穴位，可溫阳散寒，疏调经络，平衡阴阳，调整人体内部机能。本实验制备D-半乳糖所致衰老大鼠模型观察艾灸对脑组织抗氧化能力的影响，为其临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1.材料
1.1.1.实验动物清洁级健康雄性SD大鼠，体重280～300 g，由重庆滕鑫比尔实验动物销售有限公司提供，许可证号：SCXK（军）2012-0011。
1.1.2.药物与试剂吡拉西坦（产品批号2160911）;艾条（贵阳市医药公司）;脑组织SOD、MDA检测试剂盒（南京建成生物工程公司）。
1.1.3.仪器电子天平SL20001N，上海民桥精密科学仪器有限公司;低温高速离心机X-22R，美国贝克曼;722S分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;RF-5301PC荧光分光光度计，日本岛津;酶标仪（680型），美国伯乐。 1.2.方法
1.2.1.造模及分组参考文献[4]，大鼠每日定时背部皮下注射10 mg/mL的D-半乳糖溶液100 mg/kg，连续30 d，制备大鼠衰老模型。模型制作成功后，随机分为模型组、艾灸组、吡拉西坦组、正常对照组，每组10只。
1.2.2.治疗方法①艾灸组 选择百会、膈俞、气海、三阴交、膻中五穴，膈俞和三阴交的双侧穴位均取，参考《实验针灸学》[5]常用动物穴位定位法及拟人对照法定位。隔日固定进行艾灸。将大鼠所选择穴区剃毛，按顺序持艾条于穴位上方05 cm 处温和灸（以大鼠相对安静，无剧烈挣扎、嘶叫为度），每次5 min，隔日1 次，共灸15 次[6]，灸时室内无风。经预实验皮温测试，艾灸3 min 达到最高温度约44℃，之后维持在435℃左右。②吡拉西坦组：隔日一次，给予10 mg·kg-1吡拉西坦灌胃治疗。连续15次。③正常组和模型组：隔日一次，常规饲料喂养，不予其他干预性资料。
1.2.3.脑组织生化指标测定取-70℃冰箱保存脑组织加入适量裂解液进行组织匀浆。4℃，12000rpm 离心20min，取上清液测定脑组织超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）浓度。具体操作按试剂盒说明书进行。蛋白定量用考马斯亮蓝法。
1.24统计学分析定量数据以（x±s）表示，采用SPSS160统计软件分析，多组间均数的比较采用单因素方差分析，2组间均数的比较采用LSD 法。
2结果
21艾灸对衰老大鼠脑组织SOD活性的影响与正常组比较，模型组大鼠脑组织SOD活性明显降低（P<001）。与模型组相比，艾灸组大鼠脑组织SOD活性明显升高（P<001）。（表1）艾灸组和吡拉西坦组相比较无意义。表明艾灸可通过提升脑组织SOD活性，发挥其抗衰老作用。
22艾灸对衰老大鼠脑组织MDA水平的影响与正常组比较，模型组大鼠脑组织MDA水平增高，有显著性差异（P<001）。与模型组比较，艾灸组大鼠脑组织MDA水平下降，差异显著（P<005）。（表1）艾灸组和吡拉西坦组相比较无意义。表明艾灸可通过下调脑组织SOD活性，发挥其抗衰老作用。
3 讨论
衰老的确切机制目前还不清楚，存在自由基、端粒、细胞凋亡等多种学说，其中自由基学说认为氧化损伤的积累和氧化防御机能的下降在衰老过程中起关键作用[7]。自由基是一类具有高度活性的物质，可以在细胞代谢过程中直接或间接地发挥强氧化作用，如发生紊乱，体内产生的自由基及其诱导的氧化反应会使细胞发生变性、坏死，从而引起机体的衰老和疾病的发生[8]。随着年龄的增长，自由基的消长逐渐失衡，多余的自由基会持续的与生物大分子作用，产生细胞毒性和不可逆性损伤[9]。超氧化物歧化酶（SOD）广泛地存在于机体内，是抗衰老、抗肿瘤等重要的金属酶，具有保护组织免受自由基损伤的作用，其活性和含量，随年龄增长而降低，与物种寿命呈正相关，反映了机体清楚氧自由基的能力，与衰老有着密切的联系。MDA是脂质过氧化的最终产物，可反映机体内脂质过氧化程度，是细胞自由基损伤程度的指标之一[10～11]。MDA含量高低反映氧自由基水平和过氧化反应的强度和速率，是了解自由基导致机体组织、细胞损伤程度的重要指标[12]。本实验中，模型大鼠出现衰老现象，脑组织SOD活性降低，氧化产物MDA水平升高，表明了模型制作是成功的，说明脑组织抗氧化能力下降。
艾灸疗法作为中医学的重要组成部分，是我国传统的治疗方法之一。《灵枢·官能》载“针所不及，灸之所宜”;《医学入门·针灸》载“药之不及。针之不到，必须灸之”。艾灸被认为在健康条件下可以增强免疫力，在疾病状态下可抑制异常免疫反应[13]。艾灸通过热成绩、艾焦油和燃烧时产生的芳香化合物抑制过氧化物和自由基的产生[14]，部分成分清除DPPH自由基能力比常见抗氧化剂要强[15]。
中医认为，气行则血行，血行则髓生，气血调和，百病不生。衰老多属本虚标实，气滞血瘀。气虚则神失所养，瘀血则可随经脉流行入脑，与精髓错杂，致使清窍受蒙，灵机呆钝而出现神识不清，表情痴呆诸症。基于此，本研究选取百会、膈俞（双）、气海、三阴交（双）、膻中组成益气活血方。百会穴属督脉，位于巅顶，“头者神之居”为“精明之府”，且督脉总督一身之阳，有开窍醒神、回阳固脱。膈俞穴能开胸通膈可治疗气滞血瘀。气海穴可培补元气。三阴交穴属足太阴脾经，是足厥阴肝经、足太阴脾经、足少阴肾经的交会处，可健脾益气，调补肝肾。膻中穴属任脉，为气会，可理肺气、通乳络。五穴组合，共奏益气活血之功。
基于艾灸的抗衰老理论和益气活血法，我们以艾灸为治疗方法，选取百会、膈俞（双）、气海、三阴交（双）、膻中为施治穴位，以衰老大鼠作为研究对象，研究了艾灸益气活血法对亚急性衰老大鼠脑组织抗氧化能力的变化。结果表明，艾灸后衰老大鼠脑组织SOA活性升高，MDA水平下降。因此初步認为，艾灸益气活血法可通过增强衰老大鼠脑组织抗氧化能力，达到延缓衰老的目的。
参考文献：
[1]Wheeler HE，Kim SKGenetics and genomics of human ageing[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2011，366，（1561）：43-50
[2]Klartinez E，Navarro A，Ordonez C，et alOxidative stress induces apolipoproteun D overexpression in hippocampus during aging and alzheimer’s disease[J].J Alzheimers Dis，2013，36，（1）：129-144 [3]Haddadi M，Jahromi SR，Sagar BK，et alBrain aging，memory impairment and Oxidative stress：a study in Drosophia melanogaster[J].Behav Brain Res，2014，259（1）：60-69
[4]杜艳，吴海标动物衰老模型及艾灸抗衰老实验研究进展[J].广西中医学院学报，2008，11（3）：88-90
[5]李忠仁实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：327
[6]谢苏，李丽红艾灸关元、足三里对衰老小鼠免疫功能影响的实验研究[J].贵阳中医学院学报，2003，25（2）：44-46
[7]Perez VI，Bokov A，Van Remmen H，et alIs the oxidative stress theory of aging dead[J].Biochim Biophys Acta，2009，1790（10）：1005-1014）
[8]杜荣增，任雨笙，黄高忠，等茶色素对高血压病患者红细胞超氧化物歧化酶和血浆总抗氧化能力的影响[J].现代中西医结合杂志，2004，（1）：13
[9]Saltman POxidative stress：a radical view[J].Semin Hematol，989，126（4）：249
[10]王玉琳，金泽，孙忠人针刺对D-gal致衰老模型大鼠脑、肝组织SOD、MDA影响的实验研究[J].中医药信息，2011，28（4）：102-103
[11]刘灵芝丹红注射液对自然衰老大鼠心脏、大脑组织SOD、MDA 及GSH-Px的影响[J].中国实用精神疾病杂志，2012，15（17）：223
[12]李亚东，高洪泉，朱梅针刺老年大鼠“足三里”、“关元”穴对NO、SOD、MDA以及免疫影響的实验研究[J].中国针灸，2002，22（11）：46
[13]Kung YY，Chen FP，Hwang SJThe different immunomodulation of indirect moxibustion on normal subjects and patients with systemic lupus erythematosus[J].The American Journal of Chinese Medicine，2006，34（1）：47-56
[14]Chiba A，Nakanishi H，Chichibu S间接灸的温度和抗自由基作用[J].国外医学，中医中药分册，1998，20（5）：54
[15]杨梅，江丹，易筠，等艾叶燃烧物清除自由基作用的观察[J].中国针灸，2009，29（7）：547
关键词：艾灸;衰老;脑组织;免疫功能;抗氧化能力;益气活血法
中图分类号：R2855 文献标志码：B 文章编号：1007-2349（2018）05-0077-03
Effect of Qi-invigorating and Blood-activating Moxibustion Therapy on Anti-oxidative
Competence of Brain in D-galactose-induced Aging Rats
GUO Tai-hu1，MO Ming-xian1，ZHAO Chang-jin1，PAN Wen-rui1，ZHANG Yong1，TANG Zhong-sheng2（1 Class 2 of Traditional Chinese Medicine of 2014，Guiyang University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China;2 Department of Anatomy，Guiyang University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China）
【Abstract】Objective：To study the effect of moxibustion on the anti-oxidative capacity of brain tissue in D-galactose-induced aging rats Methods：Male SD rats were subcutaneously injected with D-galactose to establish the subacute aging rat models The 40 rats were randomly divided into the D-galactose injection group（n=10），the D-galactose injection with moxibustion group（n=10），the D-galactose injection with piracetam group（n=10）and the untreated group as control（n=10）following the random number table The spectrophotometry was applied to detect the changes of SOD activity and MDA level in the rat brains Results：Diminished SOD activity and elevated MDA level in the rat brains were shown with injection of D-galactose in contrast to the baseline in the untreated group，as moxibustion treatment was able to reverse the changes of SOD activity and MDA level Conclusion：Moxibustion therapy can attenuate the aging process by increasing anti-oxidative capacity in rat brains
【Key words】moxibustion，aging，brain tissue，immune function，anti-oxidative competence
衰老是指伴随着年龄增长而产生的一系列生理和解剖学方面的变化，也是人体对内环境和外环境适应能力逐渐减退的表现，是生物体在生命后期阶段出现的全身性、进行性、多因素共同作用的循序渐进的退化过程，是生命过程的必然规律[1]。最近有学者认为，衰老不仅会增加机体患病几率，衰老本身也可造成器官功能衰竭，甚至死亡，可以将衰老看成一类疾病。有研究表明，氧化应激、氧化损伤的积累和抗氧化能力下降导致衰老发生[1～2]。艾灸作为针灸学特殊疗法之一，通过温热刺激穴位，可溫阳散寒，疏调经络，平衡阴阳，调整人体内部机能。本实验制备D-半乳糖所致衰老大鼠模型观察艾灸对脑组织抗氧化能力的影响，为其临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1.材料
1.1.1.实验动物清洁级健康雄性SD大鼠，体重280～300 g，由重庆滕鑫比尔实验动物销售有限公司提供，许可证号：SCXK（军）2012-0011。
1.1.2.药物与试剂吡拉西坦（产品批号2160911）;艾条（贵阳市医药公司）;脑组织SOD、MDA检测试剂盒（南京建成生物工程公司）。
1.1.3.仪器电子天平SL20001N，上海民桥精密科学仪器有限公司;低温高速离心机X-22R，美国贝克曼;722S分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;RF-5301PC荧光分光光度计，日本岛津;酶标仪（680型），美国伯乐。 1.2.方法
1.2.1.造模及分组参考文献[4]，大鼠每日定时背部皮下注射10 mg/mL的D-半乳糖溶液100 mg/kg，连续30 d，制备大鼠衰老模型。模型制作成功后，随机分为模型组、艾灸组、吡拉西坦组、正常对照组，每组10只。
1.2.2.治疗方法①艾灸组 选择百会、膈俞、气海、三阴交、膻中五穴，膈俞和三阴交的双侧穴位均取，参考《实验针灸学》[5]常用动物穴位定位法及拟人对照法定位。隔日固定进行艾灸。将大鼠所选择穴区剃毛，按顺序持艾条于穴位上方05 cm 处温和灸（以大鼠相对安静，无剧烈挣扎、嘶叫为度），每次5 min，隔日1 次，共灸15 次[6]，灸时室内无风。经预实验皮温测试，艾灸3 min 达到最高温度约44℃，之后维持在435℃左右。②吡拉西坦组：隔日一次，给予10 mg·kg-1吡拉西坦灌胃治疗。连续15次。③正常组和模型组：隔日一次，常规饲料喂养，不予其他干预性资料。
1.2.3.脑组织生化指标测定取-70℃冰箱保存脑组织加入适量裂解液进行组织匀浆。4℃，12000rpm 离心20min，取上清液测定脑组织超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）浓度。具体操作按试剂盒说明书进行。蛋白定量用考马斯亮蓝法。
1.24统计学分析定量数据以（x±s）表示，采用SPSS160统计软件分析，多组间均数的比较采用单因素方差分析，2组间均数的比较采用LSD 法。
2结果
21艾灸对衰老大鼠脑组织SOD活性的影响与正常组比较，模型组大鼠脑组织SOD活性明显降低（P<001）。与模型组相比，艾灸组大鼠脑组织SOD活性明显升高（P<001）。（表1）艾灸组和吡拉西坦组相比较无意义。表明艾灸可通过提升脑组织SOD活性，发挥其抗衰老作用。
22艾灸对衰老大鼠脑组织MDA水平的影响与正常组比较，模型组大鼠脑组织MDA水平增高，有显著性差异（P<001）。与模型组比较，艾灸组大鼠脑组织MDA水平下降，差异显著（P<005）。（表1）艾灸组和吡拉西坦组相比较无意义。表明艾灸可通过下调脑组织SOD活性，发挥其抗衰老作用。
3 讨论
衰老的确切机制目前还不清楚，存在自由基、端粒、细胞凋亡等多种学说，其中自由基学说认为氧化损伤的积累和氧化防御机能的下降在衰老过程中起关键作用[7]。自由基是一类具有高度活性的物质，可以在细胞代谢过程中直接或间接地发挥强氧化作用，如发生紊乱，体内产生的自由基及其诱导的氧化反应会使细胞发生变性、坏死，从而引起机体的衰老和疾病的发生[8]。随着年龄的增长，自由基的消长逐渐失衡，多余的自由基会持续的与生物大分子作用，产生细胞毒性和不可逆性损伤[9]。超氧化物歧化酶（SOD）广泛地存在于机体内，是抗衰老、抗肿瘤等重要的金属酶，具有保护组织免受自由基损伤的作用，其活性和含量，随年龄增长而降低，与物种寿命呈正相关，反映了机体清楚氧自由基的能力，与衰老有着密切的联系。MDA是脂质过氧化的最终产物，可反映机体内脂质过氧化程度，是细胞自由基损伤程度的指标之一[10～11]。MDA含量高低反映氧自由基水平和过氧化反应的强度和速率，是了解自由基导致机体组织、细胞损伤程度的重要指标[12]。本实验中，模型大鼠出现衰老现象，脑组织SOD活性降低，氧化产物MDA水平升高，表明了模型制作是成功的，说明脑组织抗氧化能力下降。
艾灸疗法作为中医学的重要组成部分，是我国传统的治疗方法之一。《灵枢·官能》载“针所不及，灸之所宜”;《医学入门·针灸》载“药之不及。针之不到，必须灸之”。艾灸被认为在健康条件下可以增强免疫力，在疾病状态下可抑制异常免疫反应[13]。艾灸通过热成绩、艾焦油和燃烧时产生的芳香化合物抑制过氧化物和自由基的产生[14]，部分成分清除DPPH自由基能力比常见抗氧化剂要强[15]。
中医认为，气行则血行，血行则髓生，气血调和，百病不生。衰老多属本虚标实，气滞血瘀。气虚则神失所养，瘀血则可随经脉流行入脑，与精髓错杂，致使清窍受蒙，灵机呆钝而出现神识不清，表情痴呆诸症。基于此，本研究选取百会、膈俞（双）、气海、三阴交（双）、膻中组成益气活血方。百会穴属督脉，位于巅顶，“头者神之居”为“精明之府”，且督脉总督一身之阳，有开窍醒神、回阳固脱。膈俞穴能开胸通膈可治疗气滞血瘀。气海穴可培补元气。三阴交穴属足太阴脾经，是足厥阴肝经、足太阴脾经、足少阴肾经的交会处，可健脾益气，调补肝肾。膻中穴属任脉，为气会，可理肺气、通乳络。五穴组合，共奏益气活血之功。
基于艾灸的抗衰老理论和益气活血法，我们以艾灸为治疗方法，选取百会、膈俞（双）、气海、三阴交（双）、膻中为施治穴位，以衰老大鼠作为研究对象，研究了艾灸益气活血法对亚急性衰老大鼠脑组织抗氧化能力的变化。结果表明，艾灸后衰老大鼠脑组织SOA活性升高，MDA水平下降。因此初步認为，艾灸益气活血法可通过增强衰老大鼠脑组织抗氧化能力，达到延缓衰老的目的。
参考文献：
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[8]杜荣增，任雨笙，黄高忠，等茶色素对高血压病患者红细胞超氧化物歧化酶和血浆总抗氧化能力的影响[J].现代中西医结合杂志，2004，（1）：13
[9]Saltman POxidative stress：a radical view[J].Semin Hematol，989，126（4）：249
[10]王玉琳，金泽，孙忠人针刺对D-gal致衰老模型大鼠脑、肝组织SOD、MDA影响的实验研究[J].中医药信息，2011，28（4）：102-103
[11]刘灵芝丹红注射液对自然衰老大鼠心脏、大脑组织SOD、MDA 及GSH-Px的影响[J].中国实用精神疾病杂志，2012，15（17）：223
[12]李亚东，高洪泉，朱梅针刺老年大鼠“足三里”、“关元”穴对NO、SOD、MDA以及免疫影響的实验研究[J].中国针灸，2002，22（11）：46
[13]Kung YY，Chen FP，Hwang SJThe different immunomodulation of indirect moxibustion on normal subjects and patients with systemic lupus erythematosus[J].The American Journal of Chinese Medicine，2006，34（1）：47-56
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[15]杨梅，江丹，易筠，等艾叶燃烧物清除自由基作用的观察[J].中国针灸，2009，29（7）：547