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摘要 目的：觀察培元固本方对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及H1299肺癌小鼠生存期的影响。方法：将100只C57BL/6纯系小鼠随机分10组，每组10只。分别是正常组、Lewis肺癌对照组、Lewis肺癌+顺铂组、Lewis肺癌+高剂量组、Lewis肺癌+中剂量组、Lewis肺癌+低剂量组、H1299肺癌对照组、H1299肺癌+高剂量组、H1299肺癌+中剂量组和H1299肺癌+低剂量组。正常组、对照组和顺铂组给予0.2 mL/（只·d）生理盐水，观察组分别给予0.2 mL/（只·d）高、中、低剂量（4.496 g/mL、2.248 g/mL和1.124 g/mL）的培元固本方，连续灌胃15 d。实验结束后，测量Lewis肺癌皮下移植瘤模型小鼠的免疫器官重量、肝肾功能、瘤重和皮下瘤体积并计算抑瘤率，计算H1299肺癌腹水种植瘤模型小鼠生存率，绘制生存曲线图。结果：高、中剂量组的胸腺指数和脾脏指数与荷瘤对照组比较变化不明显（P>0.05），且低剂量组的胸腺指数明显升高（P<0.05），顺铂组的胸腺指数（P<0.01）和脾脏指数（P<0.05）均明显下降;培元固本方组的肝肾功能均正常，顺铂组肝肾功能均不正常，2组患者比较，差异有统计学意义（P<0.01）;高、中剂量组的抑瘤率分别为50%和42%，与荷瘤对照组比较瘤重减轻（P<0.05），皮下瘤体积缩小（P<0.05），顺铂组的抑瘤率为73%，与荷瘤对照组和培元固本方组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;高、中、低剂量组的生命延长率分别为：47%、55.3%和45%，生存期与荷瘤对照组比较明显延长。结论：培元固本方安全无肝肾毒性，且高、中剂量的培元固本方还具有抑制肿瘤生长、提高免疫能力和延长生存期的作用。
关键词 培元固本方;肺癌;抑瘤作用;生存期;免疫功能
Abstract Objective：To observe the effect of Peiyuan Guben Decoction on inhibiting tumor growth in mice with Lewis lung cancer and prolonging the survival time in mice with H1299 lung cancer.Methods：A total of 100 C57BL/6 mice were randomly divided into a normal group，a Lewis lung cancer control group，a Lewis lung cancer plus cisplatin group，a Lewis lung cancer plus high-dose group，a Lewis lung cancer plus medium-dose group，a Lewis lung cancer plus low-dose group，a H1299 lung cancer control group，a H1299 lung cancer plus high-dose group，a H1299 lung cancer plus medium-dose group，and a H1299 lung cancer plus low-dose group，with 10 mice in each group.The normal group，control group and cisplatin group were continuously given 0.2 mL per day of normal saline for 15 days，and the treatment groups were respectively intragastric administrated 0.2 mL per day of Peiyuan Guben Decoction at the doses of 4.496 g/mL，2.248 g/mL and 1.124 g/mL.After the trial，the immune organ weight，liver and kidney function，tumor weight and subcutaneous tumor volume were measured and the inhibition rate against tumor in mice with Lewis lung cancer was calculated.Meanwhile，the survival rate was calculated and the survival graph was drawn in mice with H1299 lung cancer.Results：Compared with the control group，the thymus index and spleen index of the high-and medium-dose groups had not significant differences（P>0.05），and the thymus index of the low-dose group was significantly increased（P<0.05）.The cisplatin group could significantly decrease the thymus index（P<0.01）and spleen index（P<0.05）.The liver and kidney functions of Peiyuan Guben Decoction were normal and the cisplatin group was abnormal，and there were significant differences between them（P<0.01）.The high-and medium-dose groups could reduce the tumor weight and the subcutaneous tumor volume compared with the control group（P<0.05），and the tumor inhibition rate was respectively 50% and 42%.The cisplatin group could reduce the tumor weight and the subcutaneous tumor volume，and the tumor inhibition rate was 73%，which was statistically significant compared with the control group and the treatment groups（P<0.05）.Peiyuan Guben Decoction could prolong the survival time，and the life extension rates of the high-，medium-and low-dose groups were respectively 47%，55.3% and 45%.Conclusion：Peiyuan Guben Decoction does not have hepatorenal toxicity and is safe.The high dose and medium dose of Peiyuan Guben Decoction could inhibit tumor growth，improve immunity function and prolong the survival time in mice with lung cancer. Key Words Peiyuan Guben Decoction; Lung cancer; Anti-tumor effect; Survival time; Immune function
中图分类号：R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.017
肿瘤一直以来在中医学史上，被认为是一种整体以虚为主，而夹杂着实性的疾病。如《难经·论五脏积病》记载“肺之积，名曰息贲，在右胁下，覆大如杯……令人洒淅寒热，喘咳，发肺壅”。《外证医编》说：“正气虚则成岩”，所以，其机体正气亏虚、邪气乘虚而入，正虚是肺癌发生发展的根本原因[1]。繆曦迪[2]等认为肿瘤本质是阳化气不足、阴寒积聚，治疗当重阳气，扶阳以抑阴。先天之阳，宜培补肾精元阳，即培元固本;后天之阳重视脾胃，温扶阳气。现代医学化疗属“苦寒”，放疗属于“火毒”等范畴，久之必将损伤脾胃，损伤人体之阳，使不足之“阳”变得更弱，助长肿瘤发展。因此在临床上，阳虚是晚期肿瘤患者放化疗后常见的症状，鞠立霞等将培元固本中药序贯化疗治疗晚期肺癌，可明显提高患者的免疫功能，降低化疗后不良反应，从而使患者能够耐受化疗，并且提高疗效[3]。
扶正固本汤可以提高患者的临床缓解率，能明显提高患者的Karnofsky评分及体质量，有效地改善患者的生命质量，还能调节免疫功能，有效地减少化疗药物的心脏毒性[4]。陈创等采用MADV_p方案联合培元固本液的中西医结合方案治疗高龄晚期非小细胞肺癌总缓解率为55.6%[5]。也有用扶正培元方能够提高肺癌患者身体状况和功能状况方面的生命质量[6-7]。因此培元固本法可贯穿于肺癌防治的全过程。培元固本方由生黄芪、熟地黄、制山药、麦冬等组成，是李雁主任治疗肺癌的经验方之一，我们将其用于治疗肺癌荷瘤小鼠，并观察其对肿瘤生长、免疫功能及荷瘤生存时间的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与细胞株 SPF级C57BL/6纯系4～5周龄的雄性小鼠105只（5只用做种鼠），体质量（20±5） g，购买于上海生命科学研究院斯莱克实验动物有限公司。小鼠购买后经紫外消毒，饲养于上海市中医医院SPF级动物房。Lewis肺癌细胞株和H1299肺癌细胞株购买于上海生命科学研究院细胞库。
1.1.2 药物 培元固本方由生黄芪30 g、熟地黄15 g、山药15 g、薏苡仁30 g、白术10 g、白茯苓10 g、麦冬15 g、天冬15 g、淫羊藿15 g、女贞子15 g、墨旱莲15 g、炒谷麦芽15 g、炙甘草6 g组成，为颗粒剂，购置于江苏江阴天江药业有限公司。按《中华人民共和国药典》的规定剂量比例，根据人-小鼠体表面积公式进行换算，将其用量的1倍、2倍及4倍于100 ℃蒸馏水中煎煮充分溶解，使其浓缩为1.124 g/mL、2.248 g/mL和4.496 g/mL 3个浓度的中药液，并进行过滤，储存在-20 ℃备用。顺铂注射液（江苏豪森药业集团有限公司，国药准字H20040813）。
1.1.3 试剂与仪器 DMEM/HIGH GLUCOSE（HyClone，美国，批号：AC10203423），胎牛血清（FBS）（Gibco，澳大利亚，批号：2045512CP），0.25%Trypsin-EDTA（Gibco，澳大利亚，批号：32146E16）。倒置显微镜（奥林巴斯，日本，型号：OLYMPUS BH-2），数码相机（佳能公司，日本，型号Canon Power Shot A75），离心机（艾本德，德国，型号：Eppendorf5810/R），二氧化碳培养箱（赛默飞，美国，型号：Thermo Scientific Forma 3110），超净工作台（赛默飞，美国，型号：Thermo Scientific Heraguard EC）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 1）分组：4～5周龄的C57BL/6雄性小鼠共100只，重量大概在20 g左右，饲养1周后接种，并随机分为10组，每组10只。分别是正常组、Lewis肺癌对照组、Lewis肺癌+顺铂组、Lewis肺癌+高剂量组、Lewis肺癌+中剂量组、Lewis肺癌+低剂量组、H1299肺癌对照组、H1299肺癌+高剂量组、H1299肺癌+中劑量组和H1299肺癌+低剂量组。2）细胞培养：Lewis肺癌细胞株和H1299肺癌细胞株生长于细胞培养液中于10 cm培养皿中培养，培养液为含10%FBS和1%双抗的DMEM培养液。细胞于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，观察细胞生长状态，隔天传代。3）Lewis肺癌皮下移植瘤模型的建立：C57BL/6纯系小鼠，适应性饲养1周后，随机分组，并设置模型对照组。用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，腹腔注射50 mg/kg，用动物剃毛器把黑鼠右前肢背部毛发剃除。动物麻醉后取对数生长期的Lewis肺癌细胞，于每只小鼠右前肢腋下皮下注射100 μL细胞悬液，含Lewis肺癌细胞3×106个。5 d后观察小鼠成瘤情况。4）H1299肺癌腹水种植瘤模型的建立：C57BL/6纯系小鼠5只，无菌条件下每只小鼠腹腔注射H1299肺癌细胞悬液1 mL，约1周行成腹水（种鼠）。另外取C57BL/6纯系小鼠，适应性饲养1周后，随机分组，无菌操作下抽取种鼠腹腔瘤液，稀释浓度为H1299肺癌细胞5×107/mL，以0.2 mL/只接种于小鼠腹腔。
1.2.2 给药方法 造模成功后，顺铂组第1天给予60 mg/kg剂量的顺铂腹腔注射;中药观察组给予培元固本方0.2 mL/（只·d）灌胃，连续15 d;正常组、荷瘤对照组和顺组给予0.2 mL/（只·d）生理盐水灌胃，连续15 d。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 小鼠生命质量及小鼠体质量变化的情况 模型建立后，每隔5 d，用电子天平称取动物的体质量，用药持续15 d后，观察小鼠体质量变化，并绘制动物体质量曲线。 1.2.3.2 免疫器官重量的测定 分别于末次给药后12 h，摘眼球放血处死，取脾脏、胸腺，并计算脾脏、胸腺指数。
1.2.3.3 生化指标的测定 分别于末次给药后第12 h，摘眼球放血处死，用全自动生化分析仪检测谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）。
1.2.3.4 抑瘤率的测定 1）模型建立后，用游标卡尺测量皮下移植瘤的大小，每隔5 d测1次，观察时间为15 d。据：瘤体公式计算体积：V=（π/8）a×b2，其中，V=肿瘤体积，a=瘤块最长直径，b=瘤块最短直径，并绘制动物瘤体生长曲线。2）连续给药15 d后处死，完整剥离小鼠腋窝皮下瘤体，用电子天平称取瘤重，用锡箔纸包住放于冰上，并储存于-80 ℃中，并绘制动物瘤体质量曲线。3）末次给药24 h后，处死小鼠，剥离肿瘤称重，计算抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%（抑瘤率≥30%为有效）。
1.2.3.5 生存期的测定 观察并记录H1299肺癌荷瘤小鼠的生存时间，并绘制生存曲线。生命延长率=（观察组平均生存期-对照组平均生存期）/对照组平均生存期。
1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，统计结果计量资料用均数±标准差（±s）表示，经正态分布检验和方差齐性检验后，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Lewis肺癌荷瘤小鼠的生命質量及体质量变化
2.1.1 小鼠生命质量 培元固本方组小鼠毛发黑亮有光泽、精神好、活动度可、饮食可，与正常组比较，差异无统计学意义，一般情况比较好;顺铂组小鼠毛发稀疏、无光泽、精神萎靡、活动度小、饮食减少，与正常组和培元固本方组比较，差异有统计学意义，一般情况比较差。
2.1.2 Lewis肺癌荷瘤小鼠体质量变化 顺铂组小鼠体质量增加缓慢，第15时体质量出现下降，与荷瘤对照组和培元固本方比较，差异有统计学意义（P<0.01）。培元固本方高、中、低3组小鼠体质量与正常组和荷瘤对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。说明顺铂抑制小鼠体质量增长，第15天时还导致体质量明显下降;而培元固本方能促进荷瘤小鼠体质量增长。见图1。
2.2 培元固本方对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫器官重量的影响 研究结果显示高、中剂量组的胸腺指数和脾脏指数，与荷瘤对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），低剂量组的胸腺指数较荷瘤对照组增高（P<0.05）;顺铂组胸腺指数和脾脏指数下降，与培元固本方组比较，差异有统计学意义（P<0.05），一定程度上说明培元固本方能提高机体的免疫能力。见表1，图2。
2.3 培元固本方对Lewis肺癌荷瘤小鼠肝肾功能的影响 肝肾毒性是化疗常见的不良反应，从表2实验数据可知，顺铂组小鼠的肝肾功能异常升高，与正常组和荷瘤对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明顺铂具有一定的肝肾毒性（图3）。而培元固本方组的肝肾功能均正常，其中低剂量组丙氨酸氨基转移酶比荷瘤对照组低（图3A），中、低剂量组的门冬氨酸氨基转移酶比荷瘤对照组低（图3B），虽然差异有统计学意义，仍在正常范围，说明没有肝肾毒性（图3）。
2.4 培元固本方对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 培元固本方高、剂量组的抑瘤率分别为50%和42%，与荷瘤对照组比较，瘤重明显减轻（P<0.05），第15天的皮下瘤体积明显缩小（P<0.05）;顺铂组的抑瘤率为73%，瘤重与荷瘤对照组和低剂量组比较减轻明显（P<0.01），与高、中剂量组比较也有减轻（P<0.05），皮下瘤体积缩小明显（P<0.05）。说明高、中剂量的培元固本方具有抑瘤作用，但弱于顺铂。见表3。
2.5 培元固本方对H1299肺癌荷瘤小鼠生存期的影响 实验结果显示培元固本方组生存期明显优于荷瘤对照组，高、中、低剂量3组的生命延长率分别为：47%、55.3%和45%，说明培元固本方能显着延长肺癌小鼠的生存期。见图5。
3 讨论
中国恶性肿瘤世界标化发病率为187.8/10万，高于世界平均水平（182.0/10万），而死亡率为111.3/10万，高于世界平均水平（102.4/10万）[8]，中医认为肿瘤的发生乃因虚而发病，因虚而致实，虚实夹杂的病症。人体的抗癌能力是本，致癌因素是标，中医认为“正气存内，邪不可干”“邪之所凑，其气必虚”。致癌因素只有在人体正气虚即人体的抗癌能力低下的时候才能使机体发病[9]。
肺癌常见中老年患者，发现时往往已中晚期，机体免疫功能低下，再加上手术、放化疗后脾肾损伤、气血俱虚，而见精神不振、形体消瘦、神疲乏力、少气懒言、面色萎黄或白光白无华、纳减腹胀，腰膝痠软、气短而喘、自汗盗汗，畏寒肢冷，舌质淡，苔白腻，脉无力，均为脾肾阳虚之证。胡国俊[10]主张肺癌的治疗必须从整体考虑，采用培元固本、扶正祛邪的方法，且以扶正为本，攻邪为标，通过扶正虚，培补顾护元气，扶助正气，抗癌消瘤，从而达到防御病邪，遏制肿瘤生长的目的。章村田认为肺癌晚期脾肾两虚多见，以补肾为主，兼以消瘤则往往能取得良好的疗效[11]。
现代研究证实扶正抗癌方总体上较顺铂作用偏弱，但依然能有效抑制肺癌细胞增殖，抑制肺癌细胞Bcl-2基因的表达，激活Bax的高表达，下调肺癌细胞中VEGF、EGFR、MMP的表达[12]。戴勇等[13]将补肾培元胶囊联合化疗治疗肺癌荷瘤小鼠，揭示补肾培元胶囊可能是通过降低Lewis肺癌小鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α炎性反应因子表达从而达到抑制肿瘤作用。同时还发现补肾培元胶囊可抑制A549细胞增殖，诱导A549细胞凋亡，其机制可能与调控MKP-1/JNK信号通路有关[14]。沈水杰[15]等证实具有培元固本作用的养肺控瘤方能抑制Lewis晚期肺癌小鼠肿瘤生长，并能与顺铂协同降低Lewis肺癌小鼠血清IL-2、TNF-α的表达水平，其抑瘤作用可能与免疫因素相关。 赵燕等[16]采用温阳益气固本方联合GP化疗方案治疗晚期NSCLC的疗效疗效优于单纯化疗，能显著减轻化疗不良反应，改善生命质量。姜恩顺[17]证实扶正培元方是通过“培元”调节了人体内在功能。虽然扶正培元方对心、肝、肾功能异常反应方面无明显作用，能够提高生命质量，改善中医证候，稳定卡氏评分等的，体现了中西医结合的特色和优势。刘松江等将培元抑瘤汤联合化疗治疗晚期肺癌，可预防化疗骨髓移植、消化道反应，无肝肾毒性，还能降低患者血清CEA水平，显著缓解患者临床症候，并使生命质量有所提高[18]。
因此，对晚期肺癌当采用扶正与抗癌、局部与全身相结合的治疗方针，以培元固本、扶正祛邪、调整气血平衡为主要要点。本研究的培元固本方中生黄芪、白术、白茯苓、山药、薏苡仁：补中益气、健脾;天冬、麦冬：滋阴润肺;熟地黄、淫羊藿、女贞子、墨旱莲：滋补肝肾;诸药合用共奏培元固本的功能。
本研究通过动物实验，证实培元固本方无论是对实体瘤还是腹水瘤，都能抑制肿瘤生长，且高、中剂量组还具有一定的提高免疫力、改善肝肾功能、延长生存率的作用。从扶正的观点，进一步为培元固本方等扶正药在治疗恶性肿瘤方面提供依据。
参考文献
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[14]戴勇，曾崎冈，段晨霞，等.补肾培元胶囊调控MKP-1/JNK抑制A549细胞增殖及诱导细胞凋亡实验研究[J].山西中医，2018，34（12）：42-46，56.
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[16]赵燕，张幼芬.温阳益气固本方联合GP化疗方案治疗晚期非小细胞肺癌的疗效观察[J].中国中医药科技，2017，24（1）：103-104.
[17]姜恩顺.扶正培元方对非小细胞肺癌化疗患者生命质量影响的临床研究[D].北京：中国中医科学院，2013.
[18]刘松江，王鹏，闫珺.培元抑瘤汤治疗非小细胞肺癌60例临床观察[J].黑龙江医学，2014，38（2）：176-177.
（2019-07-08收稿 责任编辑：王明）
关键词 培元固本方;肺癌;抑瘤作用;生存期;免疫功能
Abstract Objective：To observe the effect of Peiyuan Guben Decoction on inhibiting tumor growth in mice with Lewis lung cancer and prolonging the survival time in mice with H1299 lung cancer.Methods：A total of 100 C57BL/6 mice were randomly divided into a normal group，a Lewis lung cancer control group，a Lewis lung cancer plus cisplatin group，a Lewis lung cancer plus high-dose group，a Lewis lung cancer plus medium-dose group，a Lewis lung cancer plus low-dose group，a H1299 lung cancer control group，a H1299 lung cancer plus high-dose group，a H1299 lung cancer plus medium-dose group，and a H1299 lung cancer plus low-dose group，with 10 mice in each group.The normal group，control group and cisplatin group were continuously given 0.2 mL per day of normal saline for 15 days，and the treatment groups were respectively intragastric administrated 0.2 mL per day of Peiyuan Guben Decoction at the doses of 4.496 g/mL，2.248 g/mL and 1.124 g/mL.After the trial，the immune organ weight，liver and kidney function，tumor weight and subcutaneous tumor volume were measured and the inhibition rate against tumor in mice with Lewis lung cancer was calculated.Meanwhile，the survival rate was calculated and the survival graph was drawn in mice with H1299 lung cancer.Results：Compared with the control group，the thymus index and spleen index of the high-and medium-dose groups had not significant differences（P>0.05），and the thymus index of the low-dose group was significantly increased（P<0.05）.The cisplatin group could significantly decrease the thymus index（P<0.01）and spleen index（P<0.05）.The liver and kidney functions of Peiyuan Guben Decoction were normal and the cisplatin group was abnormal，and there were significant differences between them（P<0.01）.The high-and medium-dose groups could reduce the tumor weight and the subcutaneous tumor volume compared with the control group（P<0.05），and the tumor inhibition rate was respectively 50% and 42%.The cisplatin group could reduce the tumor weight and the subcutaneous tumor volume，and the tumor inhibition rate was 73%，which was statistically significant compared with the control group and the treatment groups（P<0.05）.Peiyuan Guben Decoction could prolong the survival time，and the life extension rates of the high-，medium-and low-dose groups were respectively 47%，55.3% and 45%.Conclusion：Peiyuan Guben Decoction does not have hepatorenal toxicity and is safe.The high dose and medium dose of Peiyuan Guben Decoction could inhibit tumor growth，improve immunity function and prolong the survival time in mice with lung cancer. Key Words Peiyuan Guben Decoction; Lung cancer; Anti-tumor effect; Survival time; Immune function
中图分类号：R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.017
肿瘤一直以来在中医学史上，被认为是一种整体以虚为主，而夹杂着实性的疾病。如《难经·论五脏积病》记载“肺之积，名曰息贲，在右胁下，覆大如杯……令人洒淅寒热，喘咳，发肺壅”。《外证医编》说：“正气虚则成岩”，所以，其机体正气亏虚、邪气乘虚而入，正虚是肺癌发生发展的根本原因[1]。繆曦迪[2]等认为肿瘤本质是阳化气不足、阴寒积聚，治疗当重阳气，扶阳以抑阴。先天之阳，宜培补肾精元阳，即培元固本;后天之阳重视脾胃，温扶阳气。现代医学化疗属“苦寒”，放疗属于“火毒”等范畴，久之必将损伤脾胃，损伤人体之阳，使不足之“阳”变得更弱，助长肿瘤发展。因此在临床上，阳虚是晚期肿瘤患者放化疗后常见的症状，鞠立霞等将培元固本中药序贯化疗治疗晚期肺癌，可明显提高患者的免疫功能，降低化疗后不良反应，从而使患者能够耐受化疗，并且提高疗效[3]。
扶正固本汤可以提高患者的临床缓解率，能明显提高患者的Karnofsky评分及体质量，有效地改善患者的生命质量，还能调节免疫功能，有效地减少化疗药物的心脏毒性[4]。陈创等采用MADV_p方案联合培元固本液的中西医结合方案治疗高龄晚期非小细胞肺癌总缓解率为55.6%[5]。也有用扶正培元方能够提高肺癌患者身体状况和功能状况方面的生命质量[6-7]。因此培元固本法可贯穿于肺癌防治的全过程。培元固本方由生黄芪、熟地黄、制山药、麦冬等组成，是李雁主任治疗肺癌的经验方之一，我们将其用于治疗肺癌荷瘤小鼠，并观察其对肿瘤生长、免疫功能及荷瘤生存时间的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与细胞株 SPF级C57BL/6纯系4～5周龄的雄性小鼠105只（5只用做种鼠），体质量（20±5） g，购买于上海生命科学研究院斯莱克实验动物有限公司。小鼠购买后经紫外消毒，饲养于上海市中医医院SPF级动物房。Lewis肺癌细胞株和H1299肺癌细胞株购买于上海生命科学研究院细胞库。
1.1.2 药物 培元固本方由生黄芪30 g、熟地黄15 g、山药15 g、薏苡仁30 g、白术10 g、白茯苓10 g、麦冬15 g、天冬15 g、淫羊藿15 g、女贞子15 g、墨旱莲15 g、炒谷麦芽15 g、炙甘草6 g组成，为颗粒剂，购置于江苏江阴天江药业有限公司。按《中华人民共和国药典》的规定剂量比例，根据人-小鼠体表面积公式进行换算，将其用量的1倍、2倍及4倍于100 ℃蒸馏水中煎煮充分溶解，使其浓缩为1.124 g/mL、2.248 g/mL和4.496 g/mL 3个浓度的中药液，并进行过滤，储存在-20 ℃备用。顺铂注射液（江苏豪森药业集团有限公司，国药准字H20040813）。
1.1.3 试剂与仪器 DMEM/HIGH GLUCOSE（HyClone，美国，批号：AC10203423），胎牛血清（FBS）（Gibco，澳大利亚，批号：2045512CP），0.25%Trypsin-EDTA（Gibco，澳大利亚，批号：32146E16）。倒置显微镜（奥林巴斯，日本，型号：OLYMPUS BH-2），数码相机（佳能公司，日本，型号Canon Power Shot A75），离心机（艾本德，德国，型号：Eppendorf5810/R），二氧化碳培养箱（赛默飞，美国，型号：Thermo Scientific Forma 3110），超净工作台（赛默飞，美国，型号：Thermo Scientific Heraguard EC）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 1）分组：4～5周龄的C57BL/6雄性小鼠共100只，重量大概在20 g左右，饲养1周后接种，并随机分为10组，每组10只。分别是正常组、Lewis肺癌对照组、Lewis肺癌+顺铂组、Lewis肺癌+高剂量组、Lewis肺癌+中剂量组、Lewis肺癌+低剂量组、H1299肺癌对照组、H1299肺癌+高剂量组、H1299肺癌+中劑量组和H1299肺癌+低剂量组。2）细胞培养：Lewis肺癌细胞株和H1299肺癌细胞株生长于细胞培养液中于10 cm培养皿中培养，培养液为含10%FBS和1%双抗的DMEM培养液。细胞于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，观察细胞生长状态，隔天传代。3）Lewis肺癌皮下移植瘤模型的建立：C57BL/6纯系小鼠，适应性饲养1周后，随机分组，并设置模型对照组。用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，腹腔注射50 mg/kg，用动物剃毛器把黑鼠右前肢背部毛发剃除。动物麻醉后取对数生长期的Lewis肺癌细胞，于每只小鼠右前肢腋下皮下注射100 μL细胞悬液，含Lewis肺癌细胞3×106个。5 d后观察小鼠成瘤情况。4）H1299肺癌腹水种植瘤模型的建立：C57BL/6纯系小鼠5只，无菌条件下每只小鼠腹腔注射H1299肺癌细胞悬液1 mL，约1周行成腹水（种鼠）。另外取C57BL/6纯系小鼠，适应性饲养1周后，随机分组，无菌操作下抽取种鼠腹腔瘤液，稀释浓度为H1299肺癌细胞5×107/mL，以0.2 mL/只接种于小鼠腹腔。
1.2.2 给药方法 造模成功后，顺铂组第1天给予60 mg/kg剂量的顺铂腹腔注射;中药观察组给予培元固本方0.2 mL/（只·d）灌胃，连续15 d;正常组、荷瘤对照组和顺组给予0.2 mL/（只·d）生理盐水灌胃，连续15 d。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 小鼠生命质量及小鼠体质量变化的情况 模型建立后，每隔5 d，用电子天平称取动物的体质量，用药持续15 d后，观察小鼠体质量变化，并绘制动物体质量曲线。 1.2.3.2 免疫器官重量的测定 分别于末次给药后12 h，摘眼球放血处死，取脾脏、胸腺，并计算脾脏、胸腺指数。
1.2.3.3 生化指标的测定 分别于末次给药后第12 h，摘眼球放血处死，用全自动生化分析仪检测谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）。
1.2.3.4 抑瘤率的测定 1）模型建立后，用游标卡尺测量皮下移植瘤的大小，每隔5 d测1次，观察时间为15 d。据：瘤体公式计算体积：V=（π/8）a×b2，其中，V=肿瘤体积，a=瘤块最长直径，b=瘤块最短直径，并绘制动物瘤体生长曲线。2）连续给药15 d后处死，完整剥离小鼠腋窝皮下瘤体，用电子天平称取瘤重，用锡箔纸包住放于冰上，并储存于-80 ℃中，并绘制动物瘤体质量曲线。3）末次给药24 h后，处死小鼠，剥离肿瘤称重，计算抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%（抑瘤率≥30%为有效）。
1.2.3.5 生存期的测定 观察并记录H1299肺癌荷瘤小鼠的生存时间，并绘制生存曲线。生命延长率=（观察组平均生存期-对照组平均生存期）/对照组平均生存期。
1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，统计结果计量资料用均数±标准差（±s）表示，经正态分布检验和方差齐性检验后，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Lewis肺癌荷瘤小鼠的生命質量及体质量变化
2.1.1 小鼠生命质量 培元固本方组小鼠毛发黑亮有光泽、精神好、活动度可、饮食可，与正常组比较，差异无统计学意义，一般情况比较好;顺铂组小鼠毛发稀疏、无光泽、精神萎靡、活动度小、饮食减少，与正常组和培元固本方组比较，差异有统计学意义，一般情况比较差。
2.1.2 Lewis肺癌荷瘤小鼠体质量变化 顺铂组小鼠体质量增加缓慢，第15时体质量出现下降，与荷瘤对照组和培元固本方比较，差异有统计学意义（P<0.01）。培元固本方高、中、低3组小鼠体质量与正常组和荷瘤对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。说明顺铂抑制小鼠体质量增长，第15天时还导致体质量明显下降;而培元固本方能促进荷瘤小鼠体质量增长。见图1。
2.2 培元固本方对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫器官重量的影响 研究结果显示高、中剂量组的胸腺指数和脾脏指数，与荷瘤对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），低剂量组的胸腺指数较荷瘤对照组增高（P<0.05）;顺铂组胸腺指数和脾脏指数下降，与培元固本方组比较，差异有统计学意义（P<0.05），一定程度上说明培元固本方能提高机体的免疫能力。见表1，图2。
2.3 培元固本方对Lewis肺癌荷瘤小鼠肝肾功能的影响 肝肾毒性是化疗常见的不良反应，从表2实验数据可知，顺铂组小鼠的肝肾功能异常升高，与正常组和荷瘤对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明顺铂具有一定的肝肾毒性（图3）。而培元固本方组的肝肾功能均正常，其中低剂量组丙氨酸氨基转移酶比荷瘤对照组低（图3A），中、低剂量组的门冬氨酸氨基转移酶比荷瘤对照组低（图3B），虽然差异有统计学意义，仍在正常范围，说明没有肝肾毒性（图3）。
2.4 培元固本方对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响 培元固本方高、剂量组的抑瘤率分别为50%和42%，与荷瘤对照组比较，瘤重明显减轻（P<0.05），第15天的皮下瘤体积明显缩小（P<0.05）;顺铂组的抑瘤率为73%，瘤重与荷瘤对照组和低剂量组比较减轻明显（P<0.01），与高、中剂量组比较也有减轻（P<0.05），皮下瘤体积缩小明显（P<0.05）。说明高、中剂量的培元固本方具有抑瘤作用，但弱于顺铂。见表3。
2.5 培元固本方对H1299肺癌荷瘤小鼠生存期的影响 实验结果显示培元固本方组生存期明显优于荷瘤对照组，高、中、低剂量3组的生命延长率分别为：47%、55.3%和45%，说明培元固本方能显着延长肺癌小鼠的生存期。见图5。
3 讨论
中国恶性肿瘤世界标化发病率为187.8/10万，高于世界平均水平（182.0/10万），而死亡率为111.3/10万，高于世界平均水平（102.4/10万）[8]，中医认为肿瘤的发生乃因虚而发病，因虚而致实，虚实夹杂的病症。人体的抗癌能力是本，致癌因素是标，中医认为“正气存内，邪不可干”“邪之所凑，其气必虚”。致癌因素只有在人体正气虚即人体的抗癌能力低下的时候才能使机体发病[9]。
肺癌常见中老年患者，发现时往往已中晚期，机体免疫功能低下，再加上手术、放化疗后脾肾损伤、气血俱虚，而见精神不振、形体消瘦、神疲乏力、少气懒言、面色萎黄或白光白无华、纳减腹胀，腰膝痠软、气短而喘、自汗盗汗，畏寒肢冷，舌质淡，苔白腻，脉无力，均为脾肾阳虚之证。胡国俊[10]主张肺癌的治疗必须从整体考虑，采用培元固本、扶正祛邪的方法，且以扶正为本，攻邪为标，通过扶正虚，培补顾护元气，扶助正气，抗癌消瘤，从而达到防御病邪，遏制肿瘤生长的目的。章村田认为肺癌晚期脾肾两虚多见，以补肾为主，兼以消瘤则往往能取得良好的疗效[11]。
现代研究证实扶正抗癌方总体上较顺铂作用偏弱，但依然能有效抑制肺癌细胞增殖，抑制肺癌细胞Bcl-2基因的表达，激活Bax的高表达，下调肺癌细胞中VEGF、EGFR、MMP的表达[12]。戴勇等[13]将补肾培元胶囊联合化疗治疗肺癌荷瘤小鼠，揭示补肾培元胶囊可能是通过降低Lewis肺癌小鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α炎性反应因子表达从而达到抑制肿瘤作用。同时还发现补肾培元胶囊可抑制A549细胞增殖，诱导A549细胞凋亡，其机制可能与调控MKP-1/JNK信号通路有关[14]。沈水杰[15]等证实具有培元固本作用的养肺控瘤方能抑制Lewis晚期肺癌小鼠肿瘤生长，并能与顺铂协同降低Lewis肺癌小鼠血清IL-2、TNF-α的表达水平，其抑瘤作用可能与免疫因素相关。 赵燕等[16]采用温阳益气固本方联合GP化疗方案治疗晚期NSCLC的疗效疗效优于单纯化疗，能显著减轻化疗不良反应，改善生命质量。姜恩顺[17]证实扶正培元方是通过“培元”调节了人体内在功能。虽然扶正培元方对心、肝、肾功能异常反应方面无明显作用，能够提高生命质量，改善中医证候，稳定卡氏评分等的，体现了中西医结合的特色和优势。刘松江等将培元抑瘤汤联合化疗治疗晚期肺癌，可预防化疗骨髓移植、消化道反应，无肝肾毒性，还能降低患者血清CEA水平，显著缓解患者临床症候，并使生命质量有所提高[18]。
因此，对晚期肺癌当采用扶正与抗癌、局部与全身相结合的治疗方针，以培元固本、扶正祛邪、调整气血平衡为主要要点。本研究的培元固本方中生黄芪、白术、白茯苓、山药、薏苡仁：补中益气、健脾;天冬、麦冬：滋阴润肺;熟地黄、淫羊藿、女贞子、墨旱莲：滋补肝肾;诸药合用共奏培元固本的功能。
本研究通过动物实验，证实培元固本方无论是对实体瘤还是腹水瘤，都能抑制肿瘤生长，且高、中剂量组还具有一定的提高免疫力、改善肝肾功能、延长生存率的作用。从扶正的观点，进一步为培元固本方等扶正药在治疗恶性肿瘤方面提供依据。
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（2019-07-08收稿 责任编辑：王明）