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摘 要：本实验以从一把伞南星（Arisaema erubescens（Wall.）Schott）组织分离到的内生细菌YBS106对三叶一心棉苗进行灌根诱导，同时挑战接种棉花枯萎病菌或棉花黄萎病菌，测定YBS106诱导对棉叶中抗性相关酶POD和PPO活性及与抗性相关的MDA和VC含量的影响，同时测定YBS106对棉花枯、黄萎病的相对防效。结果表明，YBS106诱导对POD和PPO活性及MDA和Vc含量均有显著影响。YBS106能有效诱棉叶中POD和PPO等防御酶活及Vc含量增加和MDA含量的减少，MDA和Vc含量在诱导后第5天达到最高，POD和PPO活性在诱导后第10天达到最高。病原菌挑战接种100 d时，YBS106对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的相对防效分别为64.24%和71.37%，这与棉花系统抗性相关的防御酶活及相关物质（MDA和Vc）含量的变化趋势吻合。该结果表明YBS106诱导棉花产生了对棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌的系统抗性。
关键词：内生细菌 棉花 棉花枯萎病菌 棉花黄萎病菌 诱导抗性
中图分类号：G64 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2014）03（a）-0149-03
Disease-Resistance Induction in Cotton by Inoculation with Endophytic Bacteria Strains YBS106
Lin Tianxing Guan Qinlan Gong Mingfu
（Key Laboratory of Special Biological Resources in Mountain Emei.，School of Life Sciences，Leshan
Normal Uuniversity，Leshan Sichuan 614000，China）
Abstract：The induced resistance of Serratia marcescens strain YBS106 isolated from Arisaema erubescens（Wall.）Schott tissue to cotton fusarium and verticillium wilt was studied by measuring the change of the activities of defense enzymes（POD，PPO） and the contents of pathogenesis-related biochemicals（MDA，Vc）in cotton leaf inoculation with YBS106，Fusarium oxysporum，Verticillium dahliae and the control effects of strain YBS106 against to F. oxysporum and V.dahliae in pot tests.The results indicated that YBS106 effectively increased POD and PPO activities，also promoted concentration of MDA and Vc.When the F.oxysporum or V.dahliae used with YBS106，respectively，the induced activities of POD，PPO and concentration of Vc were higher than that of only used F. oxysporum or V. dahliae，but concentration of MDA were lower.The concentration of MDA and Vc peaked 5 day after the treatment while the activities of POD and PPO reaehed their maximum 10 day after the treatrnent.The relative anti-bacterial effects of strain YBS106 against to F.oxysporum and V.dahliae in pot tests when 100 day inoculated pathogen were 64.24% and 71.37%，which is related to changes consistent trend of the defense enzymes activity and related substances（MDA and Vc）content.Systemic resistance in cotton against to Fusarium oxysporum and Verticillium dahliae could be induced by the antagonistic baeteria Serratia marcescens strain YBS106.
Key Words：Endophytic Bacteria；Cotton；Fusarium oxysporum；Verticillium dahliae；Induced resistanc
与抗病性相关的植物防御酶（如：过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL、超氧化物歧化酶SOD）的变化或诱导产生是植物遭到病原生物及逆境因子作用后维护其正常生长发育最重要的一种生理生化防御机制[1～2]。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化分解的终产物之一，植物组织中MDA的含量可以反映植物遭受病原生物及逆境因子伤害的程度[3]。抗坏血酸（Vc）是植物体内的一种抗氧化剂，可直接清除O2-和·HO，并通过抗坏血酸氧化酶使H2O2转化为水，当植物遭受病原生物及逆境因子伤害时，可降低活性氧物质对植物的毒害，使植物细胞保持正常生理功能[4]。 本课题组从一把伞南星（Arisaema erubescens（Wall.）Schott）组织中分离到一株对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）具有高拮抗活性的内生细菌YBS106，经鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），该菌可以产生活性产物抑制MRSA的生长。本试验通过测定YBS106对棉花苗体内过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO活性及MDA、Vc含量的变化情况，研究其对棉花系统抗性的诱导作用，为生防菌的开发与应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
棉花新陆早35号和军海一号从市场购买，其中新陆早35号用于枯萎病实验，军海一号用于黄萎病实验。S.marcescens YBS106由本课题组从A.erubescen中分离获得，棉花枯萎病致病菌（Fusarium oxysporum）和棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Klebahn）从感病棉花植株中分离获得。
1.2 培养基
营养琼脂培养基NA、营养肉汤培养基NB、马铃薯葡萄糖培养基PD配方参考《植病研究法》[5]。
1.3 接种前的准备
挑取一环在NA平板上生长良好的YBS106接种于NB培养液中，30 ℃、200 r/min培养48 h，加入无菌水稀释成浓度为108 CFU/ml的拮抗细菌发酵液。棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌接于PD培养液中，25 ℃、200 r/min培养72 h，稀释制成106 CFU/ml浓度的孢子悬浮液。
1.4 接种处理
待棉苗长至三叶一心时用108CFU/ml的拮抗细菌发酵液灌根接种，2 d后用106 CFU/ml浓度的病原真菌孢子悬浮液灌根进行挑战接种，分别于挑战接种病原真菌后第0、5、10、15、20天取样测定棉叶中的过氧化物酶POD和多酚氧化酶PPO的活性，同时测定棉叶中丙二醛MDA和抗坏血酸（Vc）的含量。以无菌NB培养液灌根为对照，每处理重复三次，每重复100株。各处理分别为：只接种无菌NB培养液（CK）、只接种（YBS106）、只接种棉花枯萎病菌（MK）、只接种棉花黄萎病菌（MH）、接种YBS106后挑战接种棉花枯萎病菌（YBS106-MK）、接种YBS106后挑战接种棉花黄萎病菌（YBS106-MH）。
1.5 测定指标
POD和PPO酶活以及MDA和Vc含量测定参照《植物生理学实验技术》[6]进行，以每克鲜叶重每分钟OD470增加0.01为一个POD酶活性单位，以每克鲜叶重每分钟OD525增加0.01为一个PPO酶活性单位。
出现病株后，观察记录发病株数，植株可见明显枯萎或黄萎症状，即记为发病株，共观察至接种病原菌100 d。
病情严重度分级如下。
0级：无症状，植株健康；1级：1～2片子叶局部发病；2级：子叶及一片真叶局部发病；3级：二片真叶发病或脱落仅剩心叶；4级：植株生长点或全株枯死。
发病率、病情指数及防效计算公式如下：
发病率（%）=病株数/调查总株数×100%
病情指数=（每个病级的植株数×级别数）×100/总植株数×最高级别数
相对防效（%）=（对照病情指数？处理病情指数）×100/对照病情指数
2 结果与分析
2.1 YBS106诱导下棉叶中POD活性变化
在挑战接种第0天各处理POD活性非常接近，第10天前逐渐增强，接种了拮抗菌或病原菌的处理其POD活性均比对照要高，增幅快。只接种拮抗菌的处理第10天以后POD活性逐渐下降，第15天以后和对照处于相同水平。挑战接种了病原菌的4个处理其POD活性在第10天达到最高，随后下降，其中接种了拮抗菌的2个处理比只接病原菌的2个处理POD活性升高和下降的速度都要快（见图1）。
2.2 YBS106诱导下棉叶中PPO活性变化
在挑战接种第0天各处理PPO活性非常接近，第5天普遍增强，接种了拮抗菌或病原菌的处理其PPO活性均比对照要高。只接种拮抗菌的处理第5天以后PPO活性逐渐下降，第10天以后趋于平稳，略高于对照。挑战接种了病原菌的4个处理其PPO活性在第10天达到最高，随后下降，其中接种了拮抗菌的2个处理比只接病原菌的2个处理PPO活性升高和下降的速度都要快（见图2）。
2.3 YBS106诱导下棉叶中MDA含量变化
在挑战接种第0天各处理MDA含量近乎相同，第五天普遍增加，接种了拮抗菌或病原菌的处理其MDA含量均比对照要高。对照和只接种拮抗菌其MDA含量波动范围不大。只挑战接种了病原菌的2个处理第10天前MDA含量逐渐增加，10天以后逐渐下降，15天以后趋于平稳。接种了拮抗菌并挑战接种病原菌的2个处理第5天MDA含量达到最高，随后逐渐下降，20天以后其MDA含量降至对照水平（见图3）。
2.4 YBS106诱导下棉叶中Vc含量变化
在挑战接种第0天各处理Vc含量近乎相同，第5天普遍增加，接种了拮抗菌或病原菌的处理其Vc含量均比对照要高。对照和只接种拮抗菌其Vc含量比较稳定，变化不大。挑战接种了病原菌的4个处理第5天前Vc含量逐渐增加，然后逐渐下降，其中接种了拮抗菌并挑战接种病原菌的2个处理Vc含量的上升和下降速度均比只接种病原菌的2个处理要快（见图4）。
2.5 YBS106接种对棉花枯黄萎病防治效果的影响
从盆栽实验结果来看（表1），YBS106接种对棉花枯黄萎病均有较好的防治效果，至接种棉花枯黄萎病菌100 d时对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的相对防效分别为64.24%和71.37%，但对不同病菌的防治效果存在差异。 3 结论与讨论
YBS106是本课题组从一把伞南星中分离到的一株对MRSA具有高拮抗活性的内生细菌，经鉴定为粘质沙雷氏菌（S.marcescens）， 该菌主要通过产生活性产物抑制MRSA的生长。本研究结果表明，YBS106除了对病原性细菌有抑制作用外，还能诱导棉花产生系统抗性。利用内生细菌的诱导抗性，有望成为棉花枯、黄萎病生物防治的重要措施。
YBS106虽然是从一把伞南星组织中分离获得的，但与棉花也能形成较和谐的关系，只接种拮抗菌对棉花各项指标影响不是很大，应该是这种和谐关系的体现，但YBS106是否是通过定殖到棉花组织中起作用，还需要通过实验加以证实。
同时接种拮抗菌YBS106和病原菌的处理的棉叶中POD和PPO等防御酶活及Vc含量增加和减少的速度比只接种病原菌的要快，在最高点时均高于只接种病原菌的处理棉叶，而MDA含量趋势刚好相反，这一结果与刘永锋等[2]用YD4-6和NV11-4菌株诱导水稻防御性相关酶活性变化趋势一致。该结果表明YBS106诱导后POD、PPO等防御酶及Vc等物质对诱导抗性起重要作用，大大提高了棉花对病原菌的抗性，这种抗性的提高能够通过MDA含量的变化反应出来。YBS106接种对棉花枯萎病菌和黄萎病菌均有较好的防治效果，这与棉花系统抗性相关的防御酶活及相关物质（MDA和Vc）含量的变化趋势吻合，这也说明YBS106接种诱导棉花产生了系统抗性。
参考文献
[1] John A L.Plant immuneisation；from myth to SAR[J].Pestic Sci，1999，55：193-196.
[2] 刘永锋，李美荣，陈志谊，等.YD4-6和NV11-4菌株抑菌活性及诱导水稻防御性相关酶活性变化[J].微生物学通报，2010，37（12）：1753-1759.
[3] 肖永森，王正直，郭百川.百叶枯病菌对杂交稻幼苗叶片中活性氧清除剂的影响[J].作物学报，1998，24（1）：118-122.
[4] 来玉宾.茶树内生细菌TL2分离鉴定及抗病机理的研究[D].福建农林大学硕士学位论文，2006，4.
[5] 方中达.植病研究法[M].3版.北京：中国农业出版社，2001.
[6] 萧浪涛，王三根.植物生理学实验技术[M].中国农业出版社，2005，8.
关键词：内生细菌 棉花 棉花枯萎病菌 棉花黄萎病菌 诱导抗性
中图分类号：G64 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2014）03（a）-0149-03
Disease-Resistance Induction in Cotton by Inoculation with Endophytic Bacteria Strains YBS106
Lin Tianxing Guan Qinlan Gong Mingfu
（Key Laboratory of Special Biological Resources in Mountain Emei.，School of Life Sciences，Leshan
Normal Uuniversity，Leshan Sichuan 614000，China）
Abstract：The induced resistance of Serratia marcescens strain YBS106 isolated from Arisaema erubescens（Wall.）Schott tissue to cotton fusarium and verticillium wilt was studied by measuring the change of the activities of defense enzymes（POD，PPO） and the contents of pathogenesis-related biochemicals（MDA，Vc）in cotton leaf inoculation with YBS106，Fusarium oxysporum，Verticillium dahliae and the control effects of strain YBS106 against to F. oxysporum and V.dahliae in pot tests.The results indicated that YBS106 effectively increased POD and PPO activities，also promoted concentration of MDA and Vc.When the F.oxysporum or V.dahliae used with YBS106，respectively，the induced activities of POD，PPO and concentration of Vc were higher than that of only used F. oxysporum or V. dahliae，but concentration of MDA were lower.The concentration of MDA and Vc peaked 5 day after the treatment while the activities of POD and PPO reaehed their maximum 10 day after the treatrnent.The relative anti-bacterial effects of strain YBS106 against to F.oxysporum and V.dahliae in pot tests when 100 day inoculated pathogen were 64.24% and 71.37%，which is related to changes consistent trend of the defense enzymes activity and related substances（MDA and Vc）content.Systemic resistance in cotton against to Fusarium oxysporum and Verticillium dahliae could be induced by the antagonistic baeteria Serratia marcescens strain YBS106.
Key Words：Endophytic Bacteria；Cotton；Fusarium oxysporum；Verticillium dahliae；Induced resistanc
与抗病性相关的植物防御酶（如：过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL、超氧化物歧化酶SOD）的变化或诱导产生是植物遭到病原生物及逆境因子作用后维护其正常生长发育最重要的一种生理生化防御机制[1～2]。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化分解的终产物之一，植物组织中MDA的含量可以反映植物遭受病原生物及逆境因子伤害的程度[3]。抗坏血酸（Vc）是植物体内的一种抗氧化剂，可直接清除O2-和·HO，并通过抗坏血酸氧化酶使H2O2转化为水，当植物遭受病原生物及逆境因子伤害时，可降低活性氧物质对植物的毒害，使植物细胞保持正常生理功能[4]。 本课题组从一把伞南星（Arisaema erubescens（Wall.）Schott）组织中分离到一株对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）具有高拮抗活性的内生细菌YBS106，经鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），该菌可以产生活性产物抑制MRSA的生长。本试验通过测定YBS106对棉花苗体内过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO活性及MDA、Vc含量的变化情况，研究其对棉花系统抗性的诱导作用，为生防菌的开发与应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
棉花新陆早35号和军海一号从市场购买，其中新陆早35号用于枯萎病实验，军海一号用于黄萎病实验。S.marcescens YBS106由本课题组从A.erubescen中分离获得，棉花枯萎病致病菌（Fusarium oxysporum）和棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Klebahn）从感病棉花植株中分离获得。
1.2 培养基
营养琼脂培养基NA、营养肉汤培养基NB、马铃薯葡萄糖培养基PD配方参考《植病研究法》[5]。
1.3 接种前的准备
挑取一环在NA平板上生长良好的YBS106接种于NB培养液中，30 ℃、200 r/min培养48 h，加入无菌水稀释成浓度为108 CFU/ml的拮抗细菌发酵液。棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌接于PD培养液中，25 ℃、200 r/min培养72 h，稀释制成106 CFU/ml浓度的孢子悬浮液。
1.4 接种处理
待棉苗长至三叶一心时用108CFU/ml的拮抗细菌发酵液灌根接种，2 d后用106 CFU/ml浓度的病原真菌孢子悬浮液灌根进行挑战接种，分别于挑战接种病原真菌后第0、5、10、15、20天取样测定棉叶中的过氧化物酶POD和多酚氧化酶PPO的活性，同时测定棉叶中丙二醛MDA和抗坏血酸（Vc）的含量。以无菌NB培养液灌根为对照，每处理重复三次，每重复100株。各处理分别为：只接种无菌NB培养液（CK）、只接种（YBS106）、只接种棉花枯萎病菌（MK）、只接种棉花黄萎病菌（MH）、接种YBS106后挑战接种棉花枯萎病菌（YBS106-MK）、接种YBS106后挑战接种棉花黄萎病菌（YBS106-MH）。
1.5 测定指标
POD和PPO酶活以及MDA和Vc含量测定参照《植物生理学实验技术》[6]进行，以每克鲜叶重每分钟OD470增加0.01为一个POD酶活性单位，以每克鲜叶重每分钟OD525增加0.01为一个PPO酶活性单位。
出现病株后，观察记录发病株数，植株可见明显枯萎或黄萎症状，即记为发病株，共观察至接种病原菌100 d。
病情严重度分级如下。
0级：无症状，植株健康；1级：1～2片子叶局部发病；2级：子叶及一片真叶局部发病；3级：二片真叶发病或脱落仅剩心叶；4级：植株生长点或全株枯死。
发病率、病情指数及防效计算公式如下：
发病率（%）=病株数/调查总株数×100%
病情指数=（每个病级的植株数×级别数）×100/总植株数×最高级别数
相对防效（%）=（对照病情指数？处理病情指数）×100/对照病情指数
2 结果与分析
2.1 YBS106诱导下棉叶中POD活性变化
在挑战接种第0天各处理POD活性非常接近，第10天前逐渐增强，接种了拮抗菌或病原菌的处理其POD活性均比对照要高，增幅快。只接种拮抗菌的处理第10天以后POD活性逐渐下降，第15天以后和对照处于相同水平。挑战接种了病原菌的4个处理其POD活性在第10天达到最高，随后下降，其中接种了拮抗菌的2个处理比只接病原菌的2个处理POD活性升高和下降的速度都要快（见图1）。
2.2 YBS106诱导下棉叶中PPO活性变化
在挑战接种第0天各处理PPO活性非常接近，第5天普遍增强，接种了拮抗菌或病原菌的处理其PPO活性均比对照要高。只接种拮抗菌的处理第5天以后PPO活性逐渐下降，第10天以后趋于平稳，略高于对照。挑战接种了病原菌的4个处理其PPO活性在第10天达到最高，随后下降，其中接种了拮抗菌的2个处理比只接病原菌的2个处理PPO活性升高和下降的速度都要快（见图2）。
2.3 YBS106诱导下棉叶中MDA含量变化
在挑战接种第0天各处理MDA含量近乎相同，第五天普遍增加，接种了拮抗菌或病原菌的处理其MDA含量均比对照要高。对照和只接种拮抗菌其MDA含量波动范围不大。只挑战接种了病原菌的2个处理第10天前MDA含量逐渐增加，10天以后逐渐下降，15天以后趋于平稳。接种了拮抗菌并挑战接种病原菌的2个处理第5天MDA含量达到最高，随后逐渐下降，20天以后其MDA含量降至对照水平（见图3）。
2.4 YBS106诱导下棉叶中Vc含量变化
在挑战接种第0天各处理Vc含量近乎相同，第5天普遍增加，接种了拮抗菌或病原菌的处理其Vc含量均比对照要高。对照和只接种拮抗菌其Vc含量比较稳定，变化不大。挑战接种了病原菌的4个处理第5天前Vc含量逐渐增加，然后逐渐下降，其中接种了拮抗菌并挑战接种病原菌的2个处理Vc含量的上升和下降速度均比只接种病原菌的2个处理要快（见图4）。
2.5 YBS106接种对棉花枯黄萎病防治效果的影响
从盆栽实验结果来看（表1），YBS106接种对棉花枯黄萎病均有较好的防治效果，至接种棉花枯黄萎病菌100 d时对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的相对防效分别为64.24%和71.37%，但对不同病菌的防治效果存在差异。 3 结论与讨论
YBS106是本课题组从一把伞南星中分离到的一株对MRSA具有高拮抗活性的内生细菌，经鉴定为粘质沙雷氏菌（S.marcescens）， 该菌主要通过产生活性产物抑制MRSA的生长。本研究结果表明，YBS106除了对病原性细菌有抑制作用外，还能诱导棉花产生系统抗性。利用内生细菌的诱导抗性，有望成为棉花枯、黄萎病生物防治的重要措施。
YBS106虽然是从一把伞南星组织中分离获得的，但与棉花也能形成较和谐的关系，只接种拮抗菌对棉花各项指标影响不是很大，应该是这种和谐关系的体现，但YBS106是否是通过定殖到棉花组织中起作用，还需要通过实验加以证实。
同时接种拮抗菌YBS106和病原菌的处理的棉叶中POD和PPO等防御酶活及Vc含量增加和减少的速度比只接种病原菌的要快，在最高点时均高于只接种病原菌的处理棉叶，而MDA含量趋势刚好相反，这一结果与刘永锋等[2]用YD4-6和NV11-4菌株诱导水稻防御性相关酶活性变化趋势一致。该结果表明YBS106诱导后POD、PPO等防御酶及Vc等物质对诱导抗性起重要作用，大大提高了棉花对病原菌的抗性，这种抗性的提高能够通过MDA含量的变化反应出来。YBS106接种对棉花枯萎病菌和黄萎病菌均有较好的防治效果，这与棉花系统抗性相关的防御酶活及相关物质（MDA和Vc）含量的变化趋势吻合，这也说明YBS106接种诱导棉花产生了系统抗性。
参考文献
[1] John A L.Plant immuneisation；from myth to SAR[J].Pestic Sci，1999，55：193-196.
[2] 刘永锋，李美荣，陈志谊，等.YD4-6和NV11-4菌株抑菌活性及诱导水稻防御性相关酶活性变化[J].微生物学通报，2010，37（12）：1753-1759.
[3] 肖永森，王正直，郭百川.百叶枯病菌对杂交稻幼苗叶片中活性氧清除剂的影响[J].作物学报，1998，24（1）：118-122.
[4] 来玉宾.茶树内生细菌TL2分离鉴定及抗病机理的研究[D].福建农林大学硕士学位论文，2006，4.
[5] 方中达.植病研究法[M].3版.北京：中国农业出版社，2001.
[6] 萧浪涛，王三根.植物生理学实验技术[M].中国农业出版社，2005，8.