【摘 要】
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目的 构建含UL97基因耐药相关突变的重组人巨细胞病毒(rHCMV),并通过耐药表型和基因型加以鉴定.方法 采用重叠延伸剪接PCR在UL97基因中引入Pine I位点和耐药相关位点做定点突变,将所获突变基因片段按比例与人巨细胞病毒(HCMV)AD169标准株DNA混合,经脂质体介导共转染成纤维细胞MRC-5.利用间接免疫荧光检测HCMV PP65抗原,证实MRC-5已被rHCMV感染,观察同源重组
【机 构】
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200025,上海交通大学医学院附属瑞金医院临床实验诊断中心,200025,上海交通大学医学院附属瑞金医院临床实验诊断中心,200025,上海交通大学医学院附属瑞金医院临床实验诊断中心,200025,
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目的 构建含UL97基因耐药相关突变的重组人巨细胞病毒(rHCMV),并通过耐药表型和基因型加以鉴定.方法 采用重叠延伸剪接PCR在UL97基因中引入Pine I位点和耐药相关位点做定点突变,将所获突变基因片段按比例与人巨细胞病毒(HCMV)AD169标准株DNA混合,经脂质体介导共转染成纤维细胞MRC-5.利用间接免疫荧光检测HCMV PP65抗原,证实MRC-5已被rHCMV感染,观察同源重组病毒形成的细胞病变达100%后收获该重组病毒.用不同浓度更昔洛韦进行噬斑筛选纯化目的 病毒,并通过噬斑减少试验和耐药基因(UL97和UL54)序列分析对重组病毒进行鉴定.结果 成功构建目的 突变UL97基因片段,同病毒基因组DNA共转染7 d后可见明显细胞病变,PP65抗原检测证实为rHCMV感染灶.经过克隆筛选得到的重组病毒株UL97基因型分析结果与预期一致,UL54基因测序未发现突变.阳性克隆重组病毒对更昔洛韦敏感性显示半数抑制浓度(IC50)为15 μmol/L,是标准株的12倍,具耐药表型.结论 成功将HCMV基因组DNA与耐药突变目的 基因片段共转染MRC-5细胞,通过更昔洛韦筛选和噬斑纯化获得目的 重组病毒株.该方法的建立为在用药过程中不断出现的新的HCMV耐药突变株的鉴定分析提供了有效的技术平台。
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