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摘要：目的 建立健脾复肝丸的质量标准。方法 采用薄层色谱法对当归、白术进行定性鉴别。采用高效液相色谱法测定阿魏酸含量。色谱柱：TIANHE C18 （250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.085%磷酸（17∶83）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：323 nm。结果 健脾复肝丸中当归、白术的供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上显相同颜色斑点。阿魏酸对照品在0.114～1.482 ?g范围内线性关系良好，平均加样回收率为98.36%， RSD=1.16%。结论 本方法简便准确、灵敏度高，可用于健脾复肝丸的质量控制。
关键词：健脾复肝丸；阿魏酸；薄层色谱法；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.11.017
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）11-0047-03
健脾复肝丸（浓缩丸）为本院感染科临床经验方，具有疏肝理气、健脾和胃功效，用于治疗慢性乙型病毒性肝炎辨证属肝郁气滞者。本试验对其质量标准进行研究。本方以白术、柴胡为君药，由于白术含量无标准，柴胡的薄层色谱和高效液相色谱在试验中未得到较好重复性，故选取方中另一主药当归作为研究对象。本制剂工艺中未收集当归挥发油，因此选择阿魏酸含量作为质量控制指标。现报道如下。
1 仪器与试药
LC-2010C HT高效液相色谱仪（日本岛津），包括UV可变波长检测器（美国惠普）；UV-240紫外分光光度计（日本岛津），梅特勒-托利多Excellence XP205分析天平。
白术对照药材（批号110925-200206）、当归对照药材（批号120922-200304）、阿魏酸对照品（批号110765-200613）均来自中国药品生物制品检定所，健脾复肝丸（鄂药制字Z20110548，批号20120224、20120623、20121120）及各阴性样品来自本院中药制剂室，所有试剂均为分析纯。
2 处方与制备
处方：当归175 g，陈皮175 g，枳壳175 g，黄芪219 g，
通讯作者：宋宏安，E-mail：an6945@163.com
青皮175 g，砂仁145 g，紫草292 g，虎杖292 g，丹参230 g，白芍219 g，郁金219 g，夏枯草219 g，柴胡131 g，白术175 g，法半夏100 g，赤芍219 g，山楂（焦）219 g。当归、陈皮、枳壳、白术烘干（80 ℃，12 h），粉碎，过筛（100目），其余13味药常温常压下加水浸泡1 h，加水煎煮提取3次，第1次2 h，第2次1.5 h，第3次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩得稠膏，取蜂蜜适量117 ℃炼制成中蜜与稠膏混合均匀，趁热与上细粉混合制成软材，经中药制丸机制成每粒0.3 g的小蜜丸，打光，干燥（80 ℃，12 h），灭菌，分装（60粒每瓶），即得。
3 质量标准
3.1 性状
本品为棕褐色至黑褐色的浓缩水蜜丸；气微，味微辛、涩。
3.2 薄层色谱
3.2.1 当归 取健脾复肝丸5 g研粉，加乙醚20 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺当归的健脾复肝丸5 g，同法制成阴性对照品溶液。另取当归对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照品无干扰。
3.2.2 白术 取健脾复肝丸5 g研粉，加正己烷20 mL，超声处理15 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取缺白术的健脾复肝丸5 g、白术对照药材1 g，同法制成阴性对照品溶液和对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各20 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（20∶0.1）为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置，显相同颜色斑点，阴性对照品无此特征。
3.3 阿魏酸含量测定
3.3.1 色谱条件 色谱柱：TIANHE C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.085%磷酸（17∶83）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃，检测波长：323 nm；进样量：10 ?L。理论塔板数以阿魏酸计不低于3000。
3.3.2 对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1 mL含阿魏酸228 ?g的对照品溶液。
3.3.3 供试品溶液的制备 取本品10 g，精密称定，加甲醇-甲酸（85∶15）溶液50 mL，超声处理（功率200 W，频率40 kHz） 25 min，滤过，70 ℃水浴蒸干，残渣加水40 mL溶解，加盐酸调pH值2～3，用乙醚提取5次，每次40 mL，合并乙醚液，挥干，残渣用甲醇溶解，移至20 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。
3.3.4 阴性对照品溶液的制备 取缺当归的阴性对照品1 g，按“3.3.3”项下方法制备，即得。
3.3.5 阴性干扰试验 分别取供试品、对照品、阴性对照品溶液10 ?L，注入色谱仪，测定，阴性样品在对照品位置无干扰峰。色谱图见图1。
3.3.6 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品溶液1、4、6、10、12、13 mL，分别置于20 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样10 ?L，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程Y=69.37X+16.95，r2=0.999 7，阿魏酸在0.114～1.482 ?g范围内线性关系良好。 3.3.7 精密度试验 取同一份阿魏酸对照品溶液连续重复进样6次，测定峰面积，RSD=1.25%（n=6）。
3.3.8 稳定性试验及重复性试验 取供试品溶液（批号20110623）分别于制备后0、2、4、6、8、12 h重复进样，测得阿魏酸峰面积积分值的RSD=2.36%（n=6），表明供试品溶液12 h内稳定。取该批次样品供试溶液6份，分别进样测定，计算含量RSD=1.23%，表明重复性良好。
3.3.9 加样回收率试验 精密量取同一批次（批号20111120）已知含量的供试品2 g，共6份，按“3.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密加入“3.2.2”项下阿魏酸对照品溶液1 mL，按上述色谱条件测定，结果见表1。阿魏酸平均加样回收率为98.36%，RSD=1.16%。
3.3.10 样品含量测定 取3个批次（20120224、20120623、20121120）健脾复肝丸样品，按“3.3.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件及测定方法进行含量测定，3批样品平行测定3次，测定结果见表2。
4 讨论
本试验参考文献[1-4]对色谱条件进行了选择，通过比较，最终选择乙腈-0.085%磷酸（17∶83）为流动相，使待测成份分离效果好，峰型佳，检测波长323 nm处有最大吸收。
选择提取溶媒时，对甲醇、甲醇-甲酸（85∶15）、甲醇-甲酸（90∶10）、甲醇-甲酸（95∶5）、水饱和乙酸乙酯、水进行比较，水提取，乙醚萃取乳化现象严重，干扰测定，其余5种以甲醇-甲酸（85∶15）提取效率最高，因此，选择甲醇-甲酸（85∶15）作为提取溶剂。结合阿魏酸的理化性质，进行了初步纯化，以乙醚萃取。通过对萃取次数及超声提取时间15～45 min结果进行比较，结果表明，超声提取25 min，萃取5次，阿魏酸即可提取完全。由于当归不同药用部位、不同产地中阿魏酸含量差别较大[5-6]，暂定本制剂每克含阿魏酸不低于87.5 ?g作为质控标准。
本试验采用高效液相色谱法测定制剂中阿魏酸含量，回收率好、重复性好、稳定性好、专属性高，能够更有效控制该制剂的质量。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：124.
[2] 申强，陈燕忠，吕竹芬，等.HPLC法测定祛痹舒肩丸中阿魏酸的含量[J].长治医学院学报，2008，22（4）：253.
[3] 石上梅.HPLC法测定当归康妇胶囊中阿魏酸的含量[J].中国药事，2004， 18（1）：37.
[4] 仲开德，付泽华，熊文碧.HPLC测定骨炎灵颗粒中阿魏酸的含量[J].成都中医药大学学报，2009，32（2）：85.
[5] 乔明，向纯明.HPLC对当归不同药用部位中阿魏酸含量测定[J].中医药学刊，2005，23（10）：1892.
[6] 李琰，徐丽珍，林佳，等.不同产地当归中阿魏酸的含量比较[J].中国药学杂志，2003，38（11）：839-840.
（收稿日期：2013-04-22，编辑：陈静）
关键词：健脾复肝丸；阿魏酸；薄层色谱法；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.11.017
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）11-0047-03
健脾复肝丸（浓缩丸）为本院感染科临床经验方，具有疏肝理气、健脾和胃功效，用于治疗慢性乙型病毒性肝炎辨证属肝郁气滞者。本试验对其质量标准进行研究。本方以白术、柴胡为君药，由于白术含量无标准，柴胡的薄层色谱和高效液相色谱在试验中未得到较好重复性，故选取方中另一主药当归作为研究对象。本制剂工艺中未收集当归挥发油，因此选择阿魏酸含量作为质量控制指标。现报道如下。
1 仪器与试药
LC-2010C HT高效液相色谱仪（日本岛津），包括UV可变波长检测器（美国惠普）；UV-240紫外分光光度计（日本岛津），梅特勒-托利多Excellence XP205分析天平。
白术对照药材（批号110925-200206）、当归对照药材（批号120922-200304）、阿魏酸对照品（批号110765-200613）均来自中国药品生物制品检定所，健脾复肝丸（鄂药制字Z20110548，批号20120224、20120623、20121120）及各阴性样品来自本院中药制剂室，所有试剂均为分析纯。
2 处方与制备
处方：当归175 g，陈皮175 g，枳壳175 g，黄芪219 g，
通讯作者：宋宏安，E-mail：an6945@163.com
青皮175 g，砂仁145 g，紫草292 g，虎杖292 g，丹参230 g，白芍219 g，郁金219 g，夏枯草219 g，柴胡131 g，白术175 g，法半夏100 g，赤芍219 g，山楂（焦）219 g。当归、陈皮、枳壳、白术烘干（80 ℃，12 h），粉碎，过筛（100目），其余13味药常温常压下加水浸泡1 h，加水煎煮提取3次，第1次2 h，第2次1.5 h，第3次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩得稠膏，取蜂蜜适量117 ℃炼制成中蜜与稠膏混合均匀，趁热与上细粉混合制成软材，经中药制丸机制成每粒0.3 g的小蜜丸，打光，干燥（80 ℃，12 h），灭菌，分装（60粒每瓶），即得。
3 质量标准
3.1 性状
本品为棕褐色至黑褐色的浓缩水蜜丸；气微，味微辛、涩。
3.2 薄层色谱
3.2.1 当归 取健脾复肝丸5 g研粉，加乙醚20 mL，超声处理15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺当归的健脾复肝丸5 g，同法制成阴性对照品溶液。另取当归对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照品无干扰。
3.2.2 白术 取健脾复肝丸5 g研粉，加正己烷20 mL，超声处理15 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取缺白术的健脾复肝丸5 g、白术对照药材1 g，同法制成阴性对照品溶液和对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各20 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（20∶0.1）为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置，显相同颜色斑点，阴性对照品无此特征。
3.3 阿魏酸含量测定
3.3.1 色谱条件 色谱柱：TIANHE C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.085%磷酸（17∶83）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃，检测波长：323 nm；进样量：10 ?L。理论塔板数以阿魏酸计不低于3000。
3.3.2 对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1 mL含阿魏酸228 ?g的对照品溶液。
3.3.3 供试品溶液的制备 取本品10 g，精密称定，加甲醇-甲酸（85∶15）溶液50 mL，超声处理（功率200 W，频率40 kHz） 25 min，滤过，70 ℃水浴蒸干，残渣加水40 mL溶解，加盐酸调pH值2～3，用乙醚提取5次，每次40 mL，合并乙醚液，挥干，残渣用甲醇溶解，移至20 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。
3.3.4 阴性对照品溶液的制备 取缺当归的阴性对照品1 g，按“3.3.3”项下方法制备，即得。
3.3.5 阴性干扰试验 分别取供试品、对照品、阴性对照品溶液10 ?L，注入色谱仪，测定，阴性样品在对照品位置无干扰峰。色谱图见图1。
3.3.6 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品溶液1、4、6、10、12、13 mL，分别置于20 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样10 ?L，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程Y=69.37X+16.95，r2=0.999 7，阿魏酸在0.114～1.482 ?g范围内线性关系良好。 3.3.7 精密度试验 取同一份阿魏酸对照品溶液连续重复进样6次，测定峰面积，RSD=1.25%（n=6）。
3.3.8 稳定性试验及重复性试验 取供试品溶液（批号20110623）分别于制备后0、2、4、6、8、12 h重复进样，测得阿魏酸峰面积积分值的RSD=2.36%（n=6），表明供试品溶液12 h内稳定。取该批次样品供试溶液6份，分别进样测定，计算含量RSD=1.23%，表明重复性良好。
3.3.9 加样回收率试验 精密量取同一批次（批号20111120）已知含量的供试品2 g，共6份，按“3.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密加入“3.2.2”项下阿魏酸对照品溶液1 mL，按上述色谱条件测定，结果见表1。阿魏酸平均加样回收率为98.36%，RSD=1.16%。
3.3.10 样品含量测定 取3个批次（20120224、20120623、20121120）健脾复肝丸样品，按“3.3.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件及测定方法进行含量测定，3批样品平行测定3次，测定结果见表2。
4 讨论
本试验参考文献[1-4]对色谱条件进行了选择，通过比较，最终选择乙腈-0.085%磷酸（17∶83）为流动相，使待测成份分离效果好，峰型佳，检测波长323 nm处有最大吸收。
选择提取溶媒时，对甲醇、甲醇-甲酸（85∶15）、甲醇-甲酸（90∶10）、甲醇-甲酸（95∶5）、水饱和乙酸乙酯、水进行比较，水提取，乙醚萃取乳化现象严重，干扰测定，其余5种以甲醇-甲酸（85∶15）提取效率最高，因此，选择甲醇-甲酸（85∶15）作为提取溶剂。结合阿魏酸的理化性质，进行了初步纯化，以乙醚萃取。通过对萃取次数及超声提取时间15～45 min结果进行比较，结果表明，超声提取25 min，萃取5次，阿魏酸即可提取完全。由于当归不同药用部位、不同产地中阿魏酸含量差别较大[5-6]，暂定本制剂每克含阿魏酸不低于87.5 ?g作为质控标准。
本试验采用高效液相色谱法测定制剂中阿魏酸含量，回收率好、重复性好、稳定性好、专属性高，能够更有效控制该制剂的质量。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：124.
[2] 申强，陈燕忠，吕竹芬，等.HPLC法测定祛痹舒肩丸中阿魏酸的含量[J].长治医学院学报，2008，22（4）：253.
[3] 石上梅.HPLC法测定当归康妇胶囊中阿魏酸的含量[J].中国药事，2004， 18（1）：37.
[4] 仲开德，付泽华，熊文碧.HPLC测定骨炎灵颗粒中阿魏酸的含量[J].成都中医药大学学报，2009，32（2）：85.
[5] 乔明，向纯明.HPLC对当归不同药用部位中阿魏酸含量测定[J].中医药学刊，2005，23（10）：1892.
[6] 李琰，徐丽珍，林佳，等.不同产地当归中阿魏酸的含量比较[J].中国药学杂志，2003，38（11）：839-840.
（收稿日期：2013-04-22，编辑：陈静）