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【摘要】 目的 研究银屑病患者皮损内趋化性细胞因子受体CXCR3的表达及其临床意义。方法 利用荧光定量聚合酶链反应法测定20例寻常型银屑病患者皮损内及17例正常对照者皮肤中CXCR3 mRNA的定量表达，采用直线相关回归分析方法分析CXCR3 mRNA的表达与银屑病病情严重程度(PASI)的关系。结果 银屑病皮损内CXCR3 mRNA高于正常对照者皮肤内的表达水平(P<0.01)。银屑病皮损内CXCR3 mRNA的表达与患者病情严重程度呈显著的正相关(r=0.72465，P<0.01)。结论 趋化性细胞因子受体CXCR3可能在银屑病的发病中起重要作用。
【关键词】 银屑病；趋化性细胞因子受体；CXCR3；荧光定量聚合酶链反应
文章编号：1003-1383(2007)04-0362-02
中图分类号：R 758.63
文献标识码：A
Expression and clinical significance of CXCR3 mRNA in patient with psoriasis vulgaris
MA Ze-lin1，ZHOU Zhi-gang1，Li Chang-xing1，Hu-Bin2
(1.Dongguan Hospital of Chronic Disease，523008 Dongguan，2.Daan Gene Diagnostic Center of Sun Yat-sen University，510080 Guangzhou)
【Abstract】 Objective To study the expression and clinical significance of chemokines receptor CXCR3 in psoriatic lesional skin.Methods Twenty adult patients with psoriasis vulgaris and 17 health people were sequentially chosen in this study. The production CXCR3 mRNA was measured by Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction Method. The relationship between CXCR3 and disease severity(PASI) was assessed by linear regression and correlation.Results Expression of CXCR3 mRNA in psoriasis lesional skin was higher than that in control group(P<0.01).Expression of CXCR3 mRNA was markedly positive correlation with PASI(r=0.72465，P<0.01).Conclusion Our data suggest an important role of CXCR3 in the development and advance of psoriasis vulgaris.
【Key words】 psoriasis vulgaris；chemokines receptor；CXCR3；Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction Method
银屑病是一种慢性炎症性增生性疾病，严重影响着患者的生活质量，人群发病率为0.5%～4%，其发病机制可能与遗传、细胞因子及其受体、新生血管形成、细胞凋亡异常等有关[1~3]。炎性细胞浸润运动需要在局部形成适当的趋化因子浓度梯度，同时相应的靶细胞在趋化因子的作用下向局部迁移[3]，因而趋化因子及其受体在本病发病机制中的研究越来越受到重视。为进一步研究趋化因子受体在银屑病发病中的作用，本研究采用荧光定量PCR法定量测定CXCR3在银屑病患者皮损内的表达及探讨其临床意义，现将结果报道如下。
资料和方法
1.一般资料 20例寻常型银屑病患者为2006年1～6月东莞市慢性病防治院皮肤科门诊患者(进行期)，其中男11例，女9例；年龄范围20～46岁(平均36.8岁)；病程10天～3年。所有患者治疗前2个月内未系统应用免疫抑制剂或皮质类固醇制剂或中药制剂；银屑病皮损严重指数(PASI)为8.9~48.6(30.1±14.1)。正常对照组17例为健康者外科整形手术切除的皮肤，其中男9例，女8例，年龄范围20～46岁(平均36.8岁)。
2.方法
(1)RNA的提取：组织块置匀浆器，加TRIZol冷冻匀浆，提取后的RNA，-80℃保存备用。
(2)RNA样品鉴定：电泳检查：每样品取5 μl RNA置1%的琼脂糖凝胶上电泳，泳毕溴化乙锭染色20 min，置紫外灯下观察。紫外分光光度计测吸光度值及计算样品浓度。
(3)引物的设计和合成：参考16 sRND基因文库设计引物，CXCR3引物序列如下：FO：5'-CCG TCC AGT GGG TCT TTG G -3'，RO：5'-CTG CGT AGA AGT TGA TGT TGA AGA G -3'，引物扩增片断长度为72 bp，TaqMan Probe：5'-FAM- TCT GGC CTC TGC AAA GTG GCA -TAMRA-3'，由ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。
(4)逆转录反应：取4 μl RNA模板做逆转录反应，仪器为PE9700PCR仪，反应体系如下：(德国QIAGEN 公司RT PCR试剂盒)5×逆转录buffer 4 μl，上游引物(10 pM/μl)0.4 μl，下游引物(10 pM/μl)0.4 μl，dNTPs(25 mM)0.2 μl，MMLV(10 U/μl)1 μl，DEPC水10 μl，总体积20 μl。反应条件：37℃ 1 h，然后95℃ 3 分钟。
(5)荧光定量PCR反应体系进行：由荧光定量仪PE 7000型PCR扩增仪扩增完成。反应体积为50 μl，反应体系：5×定量PCR buffer 10 μl，上游引物F1 μl，下游引物R1 μl，dNTPs0.5 μl，荧光探针1 μl，Taq 酶1.5 μl，cDNA 5 μl，ddH2O 30 μl(PCR buffer成分：10 mM Tris-HCl (pH8.0)，50 mM KCl，2 mM MgCl2)。反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃45秒，55℃45秒，共40个循环。反应结束后，计算待测样本CXCR3 mRNA表达量(copy/μg RNA)。
3.统计学分析 采用SAS 8.01 for window 统计软件进行统计分析，组间比较采用秩和检验和直线相关回归分析。
结果
1.银屑病患者皮损内CXCR3 mRNA的表达明显高于正常对照者皮肤中的表达(表1)。
表1 银屑病治疗前皮损和正常皮肤内CXCR3 mRNA的表达分组例数CXCR3 mRNA(拷贝/μg RNA)uPCXCR3组2086662.68 ±64471.11 -4.0990<0.0001正常对照1717169.08 ±27978.81
2.银屑病中CXCR3 mRNA表达与病情PASI(30.1±14.1)呈显著正相关性(r=0.72465，P=0.0003)。见图1。
讨论
银屑病组织病理学主要特征是角质形成细胞过度增生、炎症细胞浸润、新生血管形成[2，3]。炎性细胞浸润运动需要在局部形成适当的趋化因子及其受体浓度梯度，同时相应的靶细胞在趋化因子及其受体的作用下向局部迁移[4]。趋化因子最初发现的功能与炎性细胞趋化有关，但近年研究表明趋化因子及其受体与细胞因子共同参与免疫系统的调控[5]，因而趋化因子及其受体在本病发病机制中的研究越来越受到重视。IP-10在银屑病患者的皮损中表达持续上调，在活动期斑块型银屑病的角质形成细胞和真皮浸润细胞可测到IP-10，有效治疗后IP-10表达减少[6]。趋化因子的生物活性是通过结合趋化因子受体来实现的。CXCR3为IP-10特异性的受体，在IL-2活化的T细胞和嗜酸粒细胞高度表达，而在其他T细胞、B细胞、单核细胞和杆状细胞上未能检测出[7]。但关于CXCR3银屑病患者皮损内表达如何的研究甚少。本研究发现银屑病患者和健康者皮肤均有CXCR3 mRNA的表达，但银屑病患者的表达量明显高于健康对照者。此外，银屑病患者皮损内CXCR3 mRNA的表达与病情严重程度呈显著的正相关，即CXCR3 mRNA的表达量越高其病情越重，反之亦然。这些研究结果表明，银屑病患者CXCR3的过度表达可能直接或间接与其配体结合促进了炎症细胞浸润和新生血管形成，最终形成银屑病皮损。
参考文献
[1]张锡宝，何玉清，吴志华，等.银屑病患者外周血CD4+T细胞内干扰素γ、白介素4表达与发病的关系[J].中华皮肤科杂志，2003，36(3)：151-153.
[2]李常兴，张锡宝，吴志华，等.甲氨蝶呤对银屑病患者皮损内VEGFmRNA影响的研究[J].中国皮肤性病学杂志，2005，19(9)：522-524.
[3]张锡宝，李常兴， 何玉清.甲氨蝶呤对银屑病患者皮损T细胞内IFN-γmRNA影响的研究[J].中国皮肤性病学杂志，2005，19(10)：592-595.
[4]Imai T，Nagira M，Takagi S，et al.Selective recruitment of CCR4-bearing Th2 cells toward antigen-presenting cells by the CC chemokines thymus and activation-regulated chemokine and macrophage-derived chemokine[J].Int Immunol，1999，11(1)：81-88.
[5]Campbell JJ，Hedrick J，Zlotnik A，et al.Chemokines and the arrest of lymphocytes rolling under flow conditions[J].Science，1998，279(5349)：381-384.
[6]Giustizieri ML，Mascia F，Frezzolini A，et al.Keratinocytes from patients with atopic dermatitis and psoriasis show a distinct chemokine production profile in response to T cell-derived cytokines[J].J Allergy Clin Immunol，2001，107(5)：871-877.
[7]Akahira-Azuma M，Szczepanik M，Tsuji RF，et al.Early delayed-type hypersensitivity eosinophil infiltrates depend on T helper 2 cytokines and interferon-gamma via CXCR3 chemokines[J].Immunol，2004，11(3)：306-317.
(收稿日期：2007-06-18 修回日期：2007-07-20)
(编辑：潘明志 英文审校：钟京梓)
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【关键词】 银屑病；趋化性细胞因子受体；CXCR3；荧光定量聚合酶链反应
文章编号：1003-1383(2007)04-0362-02
中图分类号：R 758.63
文献标识码：A
Expression and clinical significance of CXCR3 mRNA in patient with psoriasis vulgaris
MA Ze-lin1，ZHOU Zhi-gang1，Li Chang-xing1，Hu-Bin2
(1.Dongguan Hospital of Chronic Disease，523008 Dongguan，2.Daan Gene Diagnostic Center of Sun Yat-sen University，510080 Guangzhou)
【Abstract】 Objective To study the expression and clinical significance of chemokines receptor CXCR3 in psoriatic lesional skin.Methods Twenty adult patients with psoriasis vulgaris and 17 health people were sequentially chosen in this study. The production CXCR3 mRNA was measured by Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction Method. The relationship between CXCR3 and disease severity(PASI) was assessed by linear regression and correlation.Results Expression of CXCR3 mRNA in psoriasis lesional skin was higher than that in control group(P<0.01).Expression of CXCR3 mRNA was markedly positive correlation with PASI(r=0.72465，P<0.01).Conclusion Our data suggest an important role of CXCR3 in the development and advance of psoriasis vulgaris.
【Key words】 psoriasis vulgaris；chemokines receptor；CXCR3；Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction Method
银屑病是一种慢性炎症性增生性疾病，严重影响着患者的生活质量，人群发病率为0.5%～4%，其发病机制可能与遗传、细胞因子及其受体、新生血管形成、细胞凋亡异常等有关[1~3]。炎性细胞浸润运动需要在局部形成适当的趋化因子浓度梯度，同时相应的靶细胞在趋化因子的作用下向局部迁移[3]，因而趋化因子及其受体在本病发病机制中的研究越来越受到重视。为进一步研究趋化因子受体在银屑病发病中的作用，本研究采用荧光定量PCR法定量测定CXCR3在银屑病患者皮损内的表达及探讨其临床意义，现将结果报道如下。
资料和方法
1.一般资料 20例寻常型银屑病患者为2006年1～6月东莞市慢性病防治院皮肤科门诊患者(进行期)，其中男11例，女9例；年龄范围20～46岁(平均36.8岁)；病程10天～3年。所有患者治疗前2个月内未系统应用免疫抑制剂或皮质类固醇制剂或中药制剂；银屑病皮损严重指数(PASI)为8.9~48.6(30.1±14.1)。正常对照组17例为健康者外科整形手术切除的皮肤，其中男9例，女8例，年龄范围20～46岁(平均36.8岁)。
2.方法
(1)RNA的提取：组织块置匀浆器，加TRIZol冷冻匀浆，提取后的RNA，-80℃保存备用。
(2)RNA样品鉴定：电泳检查：每样品取5 μl RNA置1%的琼脂糖凝胶上电泳，泳毕溴化乙锭染色20 min，置紫外灯下观察。紫外分光光度计测吸光度值及计算样品浓度。
(3)引物的设计和合成：参考16 sRND基因文库设计引物，CXCR3引物序列如下：FO：5'-CCG TCC AGT GGG TCT TTG G -3'，RO：5'-CTG CGT AGA AGT TGA TGT TGA AGA G -3'，引物扩增片断长度为72 bp，TaqMan Probe：5'-FAM- TCT GGC CTC TGC AAA GTG GCA -TAMRA-3'，由ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。
(4)逆转录反应：取4 μl RNA模板做逆转录反应，仪器为PE9700PCR仪，反应体系如下：(德国QIAGEN 公司RT PCR试剂盒)5×逆转录buffer 4 μl，上游引物(10 pM/μl)0.4 μl，下游引物(10 pM/μl)0.4 μl，dNTPs(25 mM)0.2 μl，MMLV(10 U/μl)1 μl，DEPC水10 μl，总体积20 μl。反应条件：37℃ 1 h，然后95℃ 3 分钟。
(5)荧光定量PCR反应体系进行：由荧光定量仪PE 7000型PCR扩增仪扩增完成。反应体积为50 μl，反应体系：5×定量PCR buffer 10 μl，上游引物F1 μl，下游引物R1 μl，dNTPs0.5 μl，荧光探针1 μl，Taq 酶1.5 μl，cDNA 5 μl，ddH2O 30 μl(PCR buffer成分：10 mM Tris-HCl (pH8.0)，50 mM KCl，2 mM MgCl2)。反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃45秒，55℃45秒，共40个循环。反应结束后，计算待测样本CXCR3 mRNA表达量(copy/μg RNA)。
3.统计学分析 采用SAS 8.01 for window 统计软件进行统计分析，组间比较采用秩和检验和直线相关回归分析。
结果
1.银屑病患者皮损内CXCR3 mRNA的表达明显高于正常对照者皮肤中的表达(表1)。
表1 银屑病治疗前皮损和正常皮肤内CXCR3 mRNA的表达分组例数CXCR3 mRNA(拷贝/μg RNA)uPCXCR3组2086662.68 ±64471.11 -4.0990<0.0001正常对照1717169.08 ±27978.81
2.银屑病中CXCR3 mRNA表达与病情PASI(30.1±14.1)呈显著正相关性(r=0.72465，P=0.0003)。见图1。
讨论
银屑病组织病理学主要特征是角质形成细胞过度增生、炎症细胞浸润、新生血管形成[2，3]。炎性细胞浸润运动需要在局部形成适当的趋化因子及其受体浓度梯度，同时相应的靶细胞在趋化因子及其受体的作用下向局部迁移[4]。趋化因子最初发现的功能与炎性细胞趋化有关，但近年研究表明趋化因子及其受体与细胞因子共同参与免疫系统的调控[5]，因而趋化因子及其受体在本病发病机制中的研究越来越受到重视。IP-10在银屑病患者的皮损中表达持续上调，在活动期斑块型银屑病的角质形成细胞和真皮浸润细胞可测到IP-10，有效治疗后IP-10表达减少[6]。趋化因子的生物活性是通过结合趋化因子受体来实现的。CXCR3为IP-10特异性的受体，在IL-2活化的T细胞和嗜酸粒细胞高度表达，而在其他T细胞、B细胞、单核细胞和杆状细胞上未能检测出[7]。但关于CXCR3银屑病患者皮损内表达如何的研究甚少。本研究发现银屑病患者和健康者皮肤均有CXCR3 mRNA的表达，但银屑病患者的表达量明显高于健康对照者。此外，银屑病患者皮损内CXCR3 mRNA的表达与病情严重程度呈显著的正相关，即CXCR3 mRNA的表达量越高其病情越重，反之亦然。这些研究结果表明，银屑病患者CXCR3的过度表达可能直接或间接与其配体结合促进了炎症细胞浸润和新生血管形成，最终形成银屑病皮损。
参考文献
[1]张锡宝，何玉清，吴志华，等.银屑病患者外周血CD4+T细胞内干扰素γ、白介素4表达与发病的关系[J].中华皮肤科杂志，2003，36(3)：151-153.
[2]李常兴，张锡宝，吴志华，等.甲氨蝶呤对银屑病患者皮损内VEGFmRNA影响的研究[J].中国皮肤性病学杂志，2005，19(9)：522-524.
[3]张锡宝，李常兴， 何玉清.甲氨蝶呤对银屑病患者皮损T细胞内IFN-γmRNA影响的研究[J].中国皮肤性病学杂志，2005，19(10)：592-595.
[4]Imai T，Nagira M，Takagi S，et al.Selective recruitment of CCR4-bearing Th2 cells toward antigen-presenting cells by the CC chemokines thymus and activation-regulated chemokine and macrophage-derived chemokine[J].Int Immunol，1999，11(1)：81-88.
[5]Campbell JJ，Hedrick J，Zlotnik A，et al.Chemokines and the arrest of lymphocytes rolling under flow conditions[J].Science，1998，279(5349)：381-384.
[6]Giustizieri ML，Mascia F，Frezzolini A，et al.Keratinocytes from patients with atopic dermatitis and psoriasis show a distinct chemokine production profile in response to T cell-derived cytokines[J].J Allergy Clin Immunol，2001，107(5)：871-877.
[7]Akahira-Azuma M，Szczepanik M，Tsuji RF，et al.Early delayed-type hypersensitivity eosinophil infiltrates depend on T helper 2 cytokines and interferon-gamma via CXCR3 chemokines[J].Immunol，2004，11(3)：306-317.
(收稿日期：2007-06-18 修回日期：2007-07-20)
(编辑：潘明志 英文审校：钟京梓)
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