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目的
探讨一种在常用真核细胞系中表达、纯化和鉴定阿尔茨海默病(AD)相关蛋白-β-分泌酶(BACE1)的方法。
方法在从人脑基因库中获取BACE1序列并成功扩增的基础上，将其插入带有增强绿色荧光蛋白(EGFP)的表达载体pEGFP-c3中。将BACE1/pEGFP-c3重组质粒用脂质体转染至HEK293细胞中表达，再通过TALON亲和色谱法分离纯化及酶切得到BACE1蛋白。用Western blotting及荧光共振能量共振转移(FRET)法鉴定BACE1的表达和体外活性。同时将BACE1/pEGFP-c3质粒与表达淀粉样前体蛋白(APP)的重组质粒(APP/pDsRed-Monomer-N1)共转染HEK293细胞，再以Western blotting法检测BACE1切割底物APP的效果。
结果(1)实验获得的BACE1基因与GenBank中的序列一致。(2)活性测定表明，空白对照组、标准BACE1阳性对照组、纯化的BACE1实验组的荧光强度分别为55.013±3.597、2639.548±207.190和1836.629±154.195，差异有统计学意义(F=78.681，P=0.000)，其中后2组差异无统计学意义(P>0.05)。(3)Western blotting结果显示转染的BACE1在细胞内可切割底物APP并产生CTF-APP条带。
结论本实验方法可成功获取BACE1基因片段并在HEK293细胞中高效表达，同时具备生物学活性，可为AD临床药物的开发提供物质基础。