【摘 要】
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为了构建microRNA-21、第十号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)真核表达载体pEGFP-N1-pre-miR21、pEGFP-N1-PTEN及短发夹状RNA(shRNA)表达载体Psilencer4.1-CMV-mi
【机 构】
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四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室,四川大学华西医院胃肠外科中心,
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为了构建microRNA-21、第十号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)真核表达载体pEGFP-N1-pre-miR21、pEGFP-N1-PTEN及短发夹状RNA(shRNA)表达载体Psilencer4.1-CMV-mir21-shRNA、Psilenc-er4.1-CMV-PTEN-shRNA,我们根据microRNA-21、PTEN基因序列设计合成shRNA及PCR引物;将microRNA-21、PTEN shRNA片段退火后的DNA模板定向克隆到Psilencer4.1-CMV质粒;另采用RT-PCR技术从人结肠癌细胞HCT-116中扩增pre-miR-21及PTEN,并将PCR产物双酶切后定向克隆到pEGFP-N1质粒上,构建重组载体。经菌落筛选、双酶切及DNA测序分析检测重组载体构建是否成功。结果显示筛选出的阳性克隆经双酶切鉴定得到与载体及目的片段大小一致的两条片段。测序证实目的基因pre-miR-21、PTEN及其shRNA序列分别正确连接到pEGFP-N1及Psilencer4.1-CMV的多克隆位点。结论:成功构建microRNA-21、PTEN基因真核表达及shR-NA表达载体,为进一步研究microRNA-21及PTEN基因在结直肠癌中的作用奠定了基础。
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