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摘 要：目的：探讨香菇多糖（LNT）与阿霉素（ADR）联合应用对胃癌SGC7901细胞凋亡及耐药基因表达的影响。方法：CCK8法检测不同浓度香菇多糖对胃癌SGC7901细胞增殖的影响，确定非细胞毒性香菇多糖的浓度;将胃癌细胞株SGC7901分为空白对照组、ADR组、ADR+LNT组，流式细胞仪检测香菇多糖与阿霉素联合应用对SGC7901细胞凋亡的影响;实时荧光PCR检测香菇多糖与阿霉素联合應用对耐药基因ZNF139、MRP-1和MDR1的转录表达的影响。结果：确定30 μg/mL香菇多糖为最大非细胞毒性浓度进行后续实验;与空白对照组及ADR组比，ADR+LNT组SGC7901/ADR细胞凋亡率明显增加（P<0.05）;与空白对照组比，ADR组ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表达明显升高（P<0.01），ADR+LNT组MRP-1基因的表达明显降低;与ADR组相比，ADR+LNT组ZNF139、MRP-1基因的表达明显降低（P<0.01）。结论：香菇多糖与阿霉素联合应用可促进胃癌SGC7901细胞凋亡，抑制耐药基因ZNF139、MRP-1的表达，逆转胃癌SGC7901细胞对阿霉素耐药性。
关键词：香菇多糖;阿霉素;胃癌SGC7901细胞;凋亡;耐药基因
香菇是起源于我国的世界第二大食用菌[1]。香菇多糖（Lentinan，LNT）是一种从香菇中提取的活性成分，是纯化的β-1，3-葡聚糖[2]。目前，香菇多糖在临床上被广泛用于肿瘤的辅助治疗。肿瘤耐药性的产生是导致治疗失败的主要原因，逆转肿瘤耐药性是提高肿瘤治疗疗效的关键。本研究以胃癌细胞SGC7901为模型，探讨香菇多糖联合阿霉素对胃癌细胞凋亡及耐药基因表达的影响，为香菇多糖抗肿瘤作用机制提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人胃癌细胞株SGC7901购自上海美轩生物科技有限公司。
1.2 试剂
香菇多糖（批号1902271）、注射用盐酸阿霉素（ADR）（25 mg，批号：G1823064）、RPMI-1640完全培养基（KGM31800S-500）、CCK8法细胞增殖检测试剂盒（KGA317）、Trizon Reagent（CW0580S）、Ultrapure RNA 超纯RNA提取试剂盒（CW0581M）、HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒（CW2569M）、UltraSYBR Mixture（CW0957M），均购自北京康为世纪生物科技有限公司;Annexin V-APC/7-AAD apoptosis kit（AP105-100kit）购自MULTI SCIENCES公司。
1.3 仪器
CO2培养箱（BPN-80CW），上海一恒科学仪器有限公司;倒置荧光显微镜（MF53），广州市明美光电有限公司;多功能酶标仪（02L3006），TECAN;荧光PCR仪（CFX Connect?实时），伯乐生命医学产品（上海）有限公司;低温高速离心机（TGL-16D），常州中捷实验仪器制造有限公司;NovoCyte?流式细胞仪（NovoCyte 2060R），艾森生物（杭州）有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 CCK8法检测香菇多糖对SGC7901细胞增殖的影响
实验设7组，分为空白对照组、6个不同浓度香菇多糖实验组。取对数生长期SGC7901细胞以1×104个/孔接种于96孔板的100 μL培养液中，培养至贴壁约70%。实验组向完全培养基中按20%的比例加入用RPMI1640培养液稀释的不同浓度的香菇多糖，使其终浓度依次为10 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，空白对照组加等体积培养液，每组设3个复孔，培养48 h，每孔加入10 μL CCK8检测溶液，再置于培养箱中孵育4 h，振荡混匀，在酶标仪上于波长450 nm处读取光密度值（OD值），重复实验3次，计算细胞生长率，见式（1）。以生长率大于90%的最高药物浓度作为非细胞毒性浓度，作为后续实验的给药量。
细胞生长率=（实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。
1.4.2 细胞造模及分组
取对数生长期SGC7901细胞，弃去细胞培养上清，用1×PBS洗两遍，用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化，离心、洗涤、重悬，按40%比例将细胞接种于6孔板，待细胞完全贴壁后，弃去上清，设空白对照组、阿霉素组（ADR组）、阿霉素和香菇多糖联合用药组（ADR+LNT组）。空白对照组加培养液1 000 μL，ADR组向SGC-7901细胞中加入含ADR（5.0 μg/mL）的培养液1 000 μL，ADR+LNT组向SGC-7901细胞中加入含ADR（5.0 μg/mL）与20%香菇多糖（终浓度为上述非细胞毒性浓度）培养液1 000 μL，培养48 h后进行流式检测和PCR检测。
1.4.3 流式细胞仪检测阿霉素与香菇多糖联合用药对细胞凋亡的影响
收集1×106～3×106个细胞，加1 mL PBS，1 500 r/min离心3 min，洗2遍，用双蒸水将5×Binding Buffer稀释为1×Binding Buffer，取300 μL预冷的1×Binding Buffer重悬细胞。每管各加入3 μL的Annexin V-APC和5 μL的7-AAD，混匀后，室温避光孵育10 min，再向每管中加入200 μL预冷的1×Binding Buffer，上机检测。
1.4.4 qPCR检测香菇多糖对多药耐药相关基因的影响
按试剂盒说明书，抽提各组SGC7901细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以GAPDH为内参，计算出各组ZNF139、MRP-1、MDR1的相对表达量。ZNF139、MRP-1、MDR1引物序列见表1。 反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个实验重复3次取平均值，检测各组SGC7901细胞内ZNF139、MRP-1、MDR1表达情况。
1.4.5 统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件进行統计分析，定量资料采用平均数±标准差（）表示，独立样本之间比较采用方差分析，以P<0.05作为显著性差异。
2 结果与分析
2.1 不同浓度香菇多糖对SGC7901细胞增殖的影响
由表2可知，30 μg/mL香菇多糖（生长率93.3%）为非细胞毒性浓度，作为后续实验的给药量。
2.2 香菇多糖对SGC7901细胞凋亡率的影响
由表3可知，与空白对照组比，ADR组和ADR+LNT组SGC7901细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。与ADR组相比，ADR+LNT组SGC7901细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。
2.3 香菇多糖对SGC7901细胞耐药基因表达的影响
由表4可知，与空白对照组比，ADR组ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表达明显升高（P<0.01），ADR+LNT组MRP-1基因的表达明显降低。与ADR组相比，ADR+LNT组ZNF139、MRP-1基因的表达明显降低（P<0.01），MDR1表达有降低趋势但无显著性差异。
3 讨论
化疗可有效遏制胃癌细胞的增殖，但在化疗中胃癌细胞多药耐药（MDR）的产生常导致化疗效果不佳[3]。阿霉素是广谱抗肿瘤药物，其本身毒性较大，但治疗效果明显，至今依然沿用。2017年阿霉素被世界卫生组织国际癌症研究机构统计在致癌物清单中，所以减少用量以及与其他抗癌药物联用成了新的研究趋势。
本实验通过不同浓度香菇多糖对SGC7901细胞增殖的影响发现（表2），低浓度香菇多糖（10 μg/mL）对SGC7901细胞增殖有一定的促进作用，当香菇多糖浓度达到30 μg/mL时开始抑制细胞增殖，当香菇多糖浓度达到100 μg/mL及以上时可显著抑制SGC7901细胞增长（P<0.05、（P<0.01），表明香菇多糖必须达到一定的药物浓度方能起到抗肿瘤作用。通过流式检测细胞凋亡实验发现（表3），香菇多糖联合阿霉素应用可明显诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的发生，说明香菇多糖与阿霉素联合应用可促进胃癌细胞凋亡的发生，为阿霉素联合用药提供实验依据。
介导肿瘤耐药的蛋白包括P-糖蛋白（P-Glycoprotein，P-gp）、多药耐药相关蛋白（Multidrug Resistance-Associated Protein，MRP）、锌指蛋白（ZNF）等[3-5]。本研究通过qPCR检测各组胃癌细胞SGC7901耐药相关基因ZNF139、MDR1、MRP的表达，结果显示（表4），与空白对照组比较ADR组ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表达明显升高（（P<0.01），表明阿霉素可通过促进胃癌细胞耐药基因的表达导致化疗失败。与空白对照组相比ADR+LNT组MRP-1基因的表达明显降低，与ADR组相比ADR+LNT组ZNF139、MRP-1基因的表达明显降低（（P<0.01），MDR1表达有降低趋势但无显著性差异，表明香菇多糖与ADR联合应用可抑制SGC7901/ADR细胞多药耐药相关基因ZNF139、MRP-1的表达。
4 结论
本研究初步表明香菇多糖可抑制胃癌SGC7901细胞的增殖，与阿霉素联合应用可促进SGC7901细胞凋亡，亦可抑制胃癌SGC7901细胞耐药基因ZNF139、MRP-1的表达而逆转化疗中对阿霉素耐药的发生。
参考文献
[1]唐庆九，王淑蕾，王晨光，等.香菇子实体中单核苷类成分研究[J].食品与生物技术学报，2017，36（3）：283-286.
[2]张晶，苏畅，贾英杰，等.香菇多糖抗肿瘤治疗临床应用进展[J].天津中医药，2019，36（11）：1137-1140.
[3]陈磊，唐圣松.P-糖蛋白在乳腺癌多药耐药中的作用及其调控机制[J].中国生物化学与分子生物学报，2014，30（3）：248-254.
[4]刘光，丁华野，皋岚湘，等.乳腺癌中Vimentin与P-糖蛋白表达和其它预后指标的相关性研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2001，10（2）：179-181.
[5]戴金锋，蔡利军，陈超英，等.温郁金逆转胃癌SGC7901/VCR多药耐药性机制的研究[J].中国中西医结合杂志，2014，34（12）：1507-1511.
关键词：香菇多糖;阿霉素;胃癌SGC7901细胞;凋亡;耐药基因
香菇是起源于我国的世界第二大食用菌[1]。香菇多糖（Lentinan，LNT）是一种从香菇中提取的活性成分，是纯化的β-1，3-葡聚糖[2]。目前，香菇多糖在临床上被广泛用于肿瘤的辅助治疗。肿瘤耐药性的产生是导致治疗失败的主要原因，逆转肿瘤耐药性是提高肿瘤治疗疗效的关键。本研究以胃癌细胞SGC7901为模型，探讨香菇多糖联合阿霉素对胃癌细胞凋亡及耐药基因表达的影响，为香菇多糖抗肿瘤作用机制提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人胃癌细胞株SGC7901购自上海美轩生物科技有限公司。
1.2 试剂
香菇多糖（批号1902271）、注射用盐酸阿霉素（ADR）（25 mg，批号：G1823064）、RPMI-1640完全培养基（KGM31800S-500）、CCK8法细胞增殖检测试剂盒（KGA317）、Trizon Reagent（CW0580S）、Ultrapure RNA 超纯RNA提取试剂盒（CW0581M）、HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒（CW2569M）、UltraSYBR Mixture（CW0957M），均购自北京康为世纪生物科技有限公司;Annexin V-APC/7-AAD apoptosis kit（AP105-100kit）购自MULTI SCIENCES公司。
1.3 仪器
CO2培养箱（BPN-80CW），上海一恒科学仪器有限公司;倒置荧光显微镜（MF53），广州市明美光电有限公司;多功能酶标仪（02L3006），TECAN;荧光PCR仪（CFX Connect?实时），伯乐生命医学产品（上海）有限公司;低温高速离心机（TGL-16D），常州中捷实验仪器制造有限公司;NovoCyte?流式细胞仪（NovoCyte 2060R），艾森生物（杭州）有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 CCK8法检测香菇多糖对SGC7901细胞增殖的影响
实验设7组，分为空白对照组、6个不同浓度香菇多糖实验组。取对数生长期SGC7901细胞以1×104个/孔接种于96孔板的100 μL培养液中，培养至贴壁约70%。实验组向完全培养基中按20%的比例加入用RPMI1640培养液稀释的不同浓度的香菇多糖，使其终浓度依次为10 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，空白对照组加等体积培养液，每组设3个复孔，培养48 h，每孔加入10 μL CCK8检测溶液，再置于培养箱中孵育4 h，振荡混匀，在酶标仪上于波长450 nm处读取光密度值（OD值），重复实验3次，计算细胞生长率，见式（1）。以生长率大于90%的最高药物浓度作为非细胞毒性浓度，作为后续实验的给药量。
细胞生长率=（实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。
1.4.2 细胞造模及分组
取对数生长期SGC7901细胞，弃去细胞培养上清，用1×PBS洗两遍，用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化，离心、洗涤、重悬，按40%比例将细胞接种于6孔板，待细胞完全贴壁后，弃去上清，设空白对照组、阿霉素组（ADR组）、阿霉素和香菇多糖联合用药组（ADR+LNT组）。空白对照组加培养液1 000 μL，ADR组向SGC-7901细胞中加入含ADR（5.0 μg/mL）的培养液1 000 μL，ADR+LNT组向SGC-7901细胞中加入含ADR（5.0 μg/mL）与20%香菇多糖（终浓度为上述非细胞毒性浓度）培养液1 000 μL，培养48 h后进行流式检测和PCR检测。
1.4.3 流式细胞仪检测阿霉素与香菇多糖联合用药对细胞凋亡的影响
收集1×106～3×106个细胞，加1 mL PBS，1 500 r/min离心3 min，洗2遍，用双蒸水将5×Binding Buffer稀释为1×Binding Buffer，取300 μL预冷的1×Binding Buffer重悬细胞。每管各加入3 μL的Annexin V-APC和5 μL的7-AAD，混匀后，室温避光孵育10 min，再向每管中加入200 μL预冷的1×Binding Buffer，上机检测。
1.4.4 qPCR检测香菇多糖对多药耐药相关基因的影响
按试剂盒说明书，抽提各组SGC7901细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以GAPDH为内参，计算出各组ZNF139、MRP-1、MDR1的相对表达量。ZNF139、MRP-1、MDR1引物序列见表1。 反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个实验重复3次取平均值，检测各组SGC7901细胞内ZNF139、MRP-1、MDR1表达情况。
1.4.5 统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件进行統计分析，定量资料采用平均数±标准差（）表示，独立样本之间比较采用方差分析，以P<0.05作为显著性差异。
2 结果与分析
2.1 不同浓度香菇多糖对SGC7901细胞增殖的影响
由表2可知，30 μg/mL香菇多糖（生长率93.3%）为非细胞毒性浓度，作为后续实验的给药量。
2.2 香菇多糖对SGC7901细胞凋亡率的影响
由表3可知，与空白对照组比，ADR组和ADR+LNT组SGC7901细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。与ADR组相比，ADR+LNT组SGC7901细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。
2.3 香菇多糖对SGC7901细胞耐药基因表达的影响
由表4可知，与空白对照组比，ADR组ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表达明显升高（P<0.01），ADR+LNT组MRP-1基因的表达明显降低。与ADR组相比，ADR+LNT组ZNF139、MRP-1基因的表达明显降低（P<0.01），MDR1表达有降低趋势但无显著性差异。
3 讨论
化疗可有效遏制胃癌细胞的增殖，但在化疗中胃癌细胞多药耐药（MDR）的产生常导致化疗效果不佳[3]。阿霉素是广谱抗肿瘤药物，其本身毒性较大，但治疗效果明显，至今依然沿用。2017年阿霉素被世界卫生组织国际癌症研究机构统计在致癌物清单中，所以减少用量以及与其他抗癌药物联用成了新的研究趋势。
本实验通过不同浓度香菇多糖对SGC7901细胞增殖的影响发现（表2），低浓度香菇多糖（10 μg/mL）对SGC7901细胞增殖有一定的促进作用，当香菇多糖浓度达到30 μg/mL时开始抑制细胞增殖，当香菇多糖浓度达到100 μg/mL及以上时可显著抑制SGC7901细胞增长（P<0.05、（P<0.01），表明香菇多糖必须达到一定的药物浓度方能起到抗肿瘤作用。通过流式检测细胞凋亡实验发现（表3），香菇多糖联合阿霉素应用可明显诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的发生，说明香菇多糖与阿霉素联合应用可促进胃癌细胞凋亡的发生，为阿霉素联合用药提供实验依据。
介导肿瘤耐药的蛋白包括P-糖蛋白（P-Glycoprotein，P-gp）、多药耐药相关蛋白（Multidrug Resistance-Associated Protein，MRP）、锌指蛋白（ZNF）等[3-5]。本研究通过qPCR检测各组胃癌细胞SGC7901耐药相关基因ZNF139、MDR1、MRP的表达，结果显示（表4），与空白对照组比较ADR组ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表达明显升高（（P<0.01），表明阿霉素可通过促进胃癌细胞耐药基因的表达导致化疗失败。与空白对照组相比ADR+LNT组MRP-1基因的表达明显降低，与ADR组相比ADR+LNT组ZNF139、MRP-1基因的表达明显降低（（P<0.01），MDR1表达有降低趋势但无显著性差异，表明香菇多糖与ADR联合应用可抑制SGC7901/ADR细胞多药耐药相关基因ZNF139、MRP-1的表达。
4 结论
本研究初步表明香菇多糖可抑制胃癌SGC7901细胞的增殖，与阿霉素联合应用可促进SGC7901细胞凋亡，亦可抑制胃癌SGC7901细胞耐药基因ZNF139、MRP-1的表达而逆转化疗中对阿霉素耐药的发生。
参考文献
[1]唐庆九，王淑蕾，王晨光，等.香菇子实体中单核苷类成分研究[J].食品与生物技术学报，2017，36（3）：283-286.
[2]张晶，苏畅，贾英杰，等.香菇多糖抗肿瘤治疗临床应用进展[J].天津中医药，2019，36（11）：1137-1140.
[3]陈磊，唐圣松.P-糖蛋白在乳腺癌多药耐药中的作用及其调控机制[J].中国生物化学与分子生物学报，2014，30（3）：248-254.
[4]刘光，丁华野，皋岚湘，等.乳腺癌中Vimentin与P-糖蛋白表达和其它预后指标的相关性研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2001，10（2）：179-181.
[5]戴金锋，蔡利军，陈超英，等.温郁金逆转胃癌SGC7901/VCR多药耐药性机制的研究[J].中国中西医结合杂志，2014，34（12）：1507-1511.