【摘 要】
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目的 建立小鼠精原干细胞(SSC)长期培养体系,探讨SSC体外增殖分化的关键因子.方法 收集出生4～6 d BALB/c绿色荧光小鼠睾丸,采用改良两步消化法获得细胞悬液,3次差速贴壁去除体
【机 构】
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武汉大学人民医院妇产科,武汉大学人民医院泌尿外科
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目的 建立小鼠精原干细胞(SSC)长期培养体系,探讨SSC体外增殖分化的关键因子.方法 收集出生4～6 d BALB/c绿色荧光小鼠睾丸,采用改良两步消化法获得细胞悬液,3次差速贴壁去除体细胞获得富集的精原细胞,采用添加生长因子的无血清基础培养液重悬,种植到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养.基础培养液为StemPro-34 SFM干细胞培养基并补充15种添加成分;生长因子为10 ng/ml碱性成纤维细胞因子、20 ng/ml胶质细胞源性神经营养因子和200 ng/mlGDNF家族受体a1.取4～5周龄BALB/c雄性小鼠15只,腹腔注射40 mg/kg的白消安建立受体模型,采用三维显微注射系统将培养的SSC移植到受体左侧睾丸精曲小管内,右侧睾丸作为自身对照;分别采用体视荧光显微镜观察和HE染色检测细胞移植后睾丸生精功能恢复情况.结果 改良消化富集法消化后细胞活性>98%,SSC富集约18.5倍.饲养层培养1～2 d后细胞成对称或线形排列,细胞间可见明显的胞质桥连接.3～4 d后精原细胞增殖形成典型的克隆,为边缘不清楚的团块;小鼠SSC能在该培养体系中稳定培养、传代3个月.移植后2个月,体视荧光显微镜下受体睾丸内可见明显绿色阳性克隆,HE染色证实移植的SSC在受体睾丸内克隆增殖并分化产生成熟的精子.结论 成功建立了BALB/c小鼠SSC培养体系,为研究SSC增殖分化调控机制及SSC移植治疗男性不育提供了实验依据.
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