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【摘 要】在目前，越来越多的天然活性小分子成为了临床治疗冠心病的候选药物。然而这些天然药物大多在水中难溶解，不稳定，这使得它们在临床上的应用遭受到了巨大的限制。本项目主要探究的是：酪蛋白纳米胶束的包藏对药物丹参酮的稳态的影响。首先，我们利用酪蛋白的自组装功能，将丹参酮（tanshinone）包藏于酪蛋白中形成纳米胶束。在包封完成后，分别测量丹参酮-NaC复合物的包封率、表征、绘制紫外可见吸收光谱及抗菌活性研究。最后得出结论：丹参酮-NaC纳米胶束复合物的构建显著提高了丹参酮的稳定性，为将来药物研究提供了新的方法和思路。
【关键词】酪蛋白;丹参酮;纳米胶束;药物稳态;抑菌活性
Abstract：At present， more and more natural active small molecules have become the candidate drugs for clinical treatment of coronary heart disease. However， most of these natural drugs are insoluble and unstable in water， which limits their clinical application greatly. This project mainly explores the effects of casein nanomicelle encapsulation on tanshinone homeostasis. First， we used the self-assembly function of casein to encapsulate Tanshinone in casein to form nano-micelles. After the completion of encapsulation， the encapsulation rate and solubility of tanshinone-NAC complex were measured， and antibacterial activities were characterized and mapped. Finally， the conclusion was drawn that the construction of tanshinone -NaC nano-micellar complex significantly improved the stability of Tanshinone and provided new methods and ideas for future drug research.
Keywords： Casein; tanshinone; Micelle; Drug Stability; Bacteriostatic activity
1.绪论
1.1引文
冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病”。冠心病主要是由于冠状动脉出现多样硬化引起的，它是一种终身性疾病，血管中的斑块一旦形成，很难彻底的消除，我们只能够通过长期用药稳定病情。然而，持续服用目前治疗冠心病的药物会对肝、肾等器官产生明显的危害，甚至还会引起头疼、呕吐的情况;但是一旦停止药物，也将会引发非常严重的后果。
相比传统的治疗冠心病的药物，越来越多的天然生物活性分子因其低毒性，被认为是作为治疗冠心病的长期服用药物，最有希望的候选者。丹参酮（Salvia miltiorrhiza Bunge） 是从中药丹参（唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge根）中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，经临床试用证明治疗心绞痛效果显著，副作用小，为一治疗冠心病的新药。丹参酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等多方面作用，长期服用未见有明显副作用。但稳定性差，易受温度、pH及溶剂影响，发生不同程度的解离，影响药物效果。因此，开发新型有效的药物包藏系統势在必行。构建药物包藏系统的目的是增强药物的水溶性、稳定性，因此，药物的良好的生物相容性，会逐步展现出在癌症临床治疗中的巨大潜力。
酪蛋白是一种两亲性大分子共聚物，能够发生自组装成为一种优良的包埋材料，具有良好的稳定性并且能与小分子和离子相结合，能够通过控制外部条件改变其结构和特性。酪蛋白胶粒的两亲性和自组装特性有助于提高其稳定性。本项目探究酪蛋白纳米胶束对药物的稳态的影响，实验从以下几个方面开展工作：首先，利用酪蛋白自身的自组装特性将丹参酮包藏于酪蛋白中，形成丹参酮-NaC纳米胶束复合物并测量其包封率;其次，利用紫外分光光度计分别对游离的丹参酮、游离的酪蛋白及酪蛋白纳米复合物进行表征，并绘制出相应的紫外可见吸收光谱图;在包封完成后，测量纳米复合物的最小抑菌浓度，探究其生物活性，期望为冠心病的临床治疗做出一定的贡献。
1.2丹参酮
（1）理化性质。丹参酮，又名总丹参酮，是从中药丹参（唇形科植物丹参根）中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，从中分得丹参酮I、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、异隐丹参酮等10余个丹参酮单体，其中隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅱ，羟基丹参酮、丹参酸甲酯、丹参酮ⅡB 5个单体。
（2）生理功能。隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅱ，羟基丹参酮、丹参酸甲酯、丹参酮ⅡB 5个单体具有抗菌作用，且有抗炎、降温作用。丹参酮ⅡA的磺化产物丹参酮ⅡA磺酸钠能溶于水，经临床试用证明治疗心绞痛效果显著，副作用小，为一治疗冠心病的新药。丹参酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等多方面作用，长期服用未见有明显副作用。 1.3酪蛋白
（1）理化性质。纯酪蛋白为白色、无味、无臭的粒状固体。相对密度约1.26。不溶于水和有机溶剂。酪蛋白为非结晶、非吸潮性物质，常温下在水中可溶解0.8-1.2%，微溶于25℃水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分，当浸入水中则迅速膨胀，但分子不结合。
（2）酪蛋白纳米胶束。酪蛋白是一种两亲性大分子共聚物，能够发生自组装成为一种优良的包埋材料，具有良好的稳定性并且能与小分子和离子相结合，能够通过控制外部条件改变其结构和特性。其胶粒的两亲性和自组装特性有助于提高其稳定性。
1.4本选题研究的意义及主要内容
本选题研究的意义是：天然化合物丹参酮具有多种生理功能，其中，丹参酮治疗冠心病的效果和机制已经得到了广泛的报道和应用。然而，它存在着水溶性差、遇光热易分解、化学稳定度低、代谢快、半衰期短、难以被生物体吸收和利用等缺点。为了解决药物传递过程中药效降低和药物释放的难题，开发更加安全高效的药物递送系统迫在眉睫。
酪蛋白是一种两亲性大分子共聚物，能够发生自组装成为一种优良的包埋材料，具有良好的稳定性并且能与小分子和离子相结合，能够通过控制外部条件改变其结构和特性。其胶粒的两亲性和自组装特性有助于提高其稳定性。
本课题的主要内容是：选取酪蛋白酸钠包藏丹参酮，探究酪蛋白纳米胶束的包藏对药物的稳态的影响。首先，利用酪蛋白的自组装功能将丹参酮（tanshinone）包藏于酪蛋白中以形成纳米胶束。包封完成后，分别测量丹参酮-NaC复合物的包封率、绘制紫外可见吸收光谱以及储藏稳定性及抗菌活性研究。最后得出结论：丹参酮-NaC纳米胶束复合物的构建显著提高了丹参酮的储存稳定性，为将来药物研究提供了新的方法和思路。
2.纳米复合物的制备
2.1实验材料
丹参酮ⅡB、酪蛋白酸钠、95%乙醇、磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钾、胰蛋白胨、牛心浸出粉、氯化钠、葡萄糖
2.2实验仪器
电子天平、pH计、恒温水浴锅、磁力搅拌器、紫外分光光度计、红外光谱仪、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅
2.3实验方法
（1）配制丹参酮溶液。①计算丹参酮粉末的质量：50mL*1mg/mL=0.05克。②用电子天平称0.05克丹参酮于烧杯中，加少量95%乙醇溶解，然后倒入50毫升容量瓶里，分3次洗烧杯，将溶液全部倒入容量瓶里。③用95%乙醇稀释至刻度线，摇匀，即可得到50ml浓度为1mg/ml的丹参酮溶液。
（2）配制酪蛋白酸钠溶液。①分别计算酪蛋白酸钠粉末的质量为：0.5g、0.4g、0.3g、0.2g、0.1g。②用电子天平分别称取酪蛋白粉末于烧杯中，加少量水溶解，然后倒入50毫升容量瓶里，分3次洗烧杯，将溶液全部倒入容量瓶里。③用水稀释至刻度线，摇匀，即可得到50ml的5个不同浓度的溶液。
（3）配置100ml，pH为7.4的PBS溶液。①用电子天平称0.156克磷酸二氢钠、0.35814g十二水合磷酸氢二钾于烧杯中，加少量水溶解。②将其倒入100毫升容量瓶里，分3次洗烧杯，将溶液全部倒入容量瓶里。③用水稀释至刻度线，摇匀，即可得到100ml浓度为1mg/ml的pH为7.4的PBS溶液。
（4）绘制酪蛋白酸钠的标准曲线。①分别用乙醇配置浓度梯度为2、4、6、8、10 μg / mL 的酪蛋白酸钠标准溶液。②用高效液相色谱 （HPLC， LC-20A） 检测酪蛋白酸钠标准溶液。③在word中分别输入酪蛋白酸钠溶液浓度及其对应的吸光度，做其对应的吸光度与酪蛋白酸钠溶液浓度的趋势线，并求其回归方程。（色谱条件：流动相为乙腈：0.5 %乙酸水 （44：56）;检测波长为428 nm;流速为1 mL / min;柱温为35 ℃;进样体积为20 μL。）
（5）用酪蛋白酸钠包藏丹参酮。①将容量瓶中的PBS溶液与酪蛋白酸钠溶液用量筒分别量取50ml至烧杯中，用移液枪移取5ml的丹参酮乙醇溶液于试管中。②将烧杯放在磁力搅拌器中央位置，调整转速为600转，边搅拌边滴加丹参酮乙醇溶液于烧杯中。③静止烧杯于磁力搅拌器中央，搅拌2小时。
（6）测定丹参酮-酪蛋白酸钠胶束的包藏率。①取上述包藏完毕的混合液于离心管中，将离心管放入离心机中离心1h。②取上清液，用紫外分光光度计测其吸光度三次并记录。根据之前得出的酪蛋白酸钠的标准曲线计算出丹参酮的包藏质量，计算出参酮-酪蛋白酸钠胶束的包藏率。
（7）丹参酮溶解度的测定。①用去离子水配制500μg/mL的丹參酮-PBS混合液200mL。②将配制好的混合液于超声波溶解仪中超声20min以上，发现明显未溶固体。③改用无水乙醇配制500μg/mL的丹参酮-乙醇溶液，超声20min，未溶固体量减少。④用紫外分光光度计测上述丹参酮-乙醇溶液吸光度，确定其溶解情况。⑤其结果为0.161，数值较低。丹参酮在无水乙醇中溶解度较小，而在PBS溶液中明显难溶，表明丹参酮溶解性较差。
（8）酪蛋白纳米复合物的表征。采用紫外可见吸收光谱检测0.05g/L的丹参酮溶液，1g/L的酪蛋白酸钠溶液，和原先已配置的丹参酮-NaC复合物溶液的光谱特性。
（9）制备金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的菌悬液。①量取600ml水，按比例称取牛肉粉3g、氯化钠3g、蛋白胨6g，混合溶解，配得600ml培养液，分装到六个锥形瓶中。②锥形瓶加棉塞，瓶口用报纸包裹，并用麻绳扎好，防止灭菌时冷凝水浸润棉塞，用记号笔标记姓名日期。③检查灭菌锅水位险保证水位线高于最低水位。④将包好的三角烧瓶放入锅中。盖上锅盖，先拧紧盖，后拧紧螺栓。⑤打开排气阀并打开电源，设定温度120度开始加热，当锅内水温达到100度，等待几分钟。⑥灭菌时间到达后切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表压力为零时，打开排气阀，松开螺栓，打开盖子，取出培养皿。⑦取已制好灭菌过的培养基和培养皿。拆开包培养皿的报纸，点燃酒精灯，进行无菌操作，掀开报纸，取下棉塞。另一手抓住培养基底部，培养基口对火焰。左手大拇指和食指撑住皿盖。剩下三指托住皿底，在火焰旁打开皿盖。将培养基液体缓缓倒入培养皿中，静置，待其凝固后倒置。⑧待其凝固后，将金黄色葡萄球菌与大肠杆菌分别接种在牛肉膏蛋白胨平板上，保持37°C恒温培养24h，活化后用10ml无菌水配置成菌悬液。 （10）用96孔板法测最小抑菌浓度。①在96孔培养板所有实验孔中，分别加入空白肉汤100μL。②在96孔培养板第一排，分别加入25μg/m L的酪蛋白纳米复合物100μL，然后对药物进行二倍稀释，即第1孔中加入药液后用移液枪充分吹打（至少3次以上）使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μL加入第2孔，再充分吹打使之与肉汤充分混匀，同样吸取100μL加人第3孔中.照此重复直至最后一孔，吸取100μL弃去;此时每孔药物浓度从上到下依次为25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.390μg/ml，并在第二列與第三列设置平行实验。③在每一孔中加入稀释好的大肠杆菌悬液100μL，这样就形成测定一个药物最小抑菌浓度值的3次重复。此时每孔药物浓度即最终药物浓度，从上到下依次为25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.390μg/ml。④继续在每一孔中加入刃天青染液，区分抑菌效果。⑤重复上述步骤，再制作一个金黄色葡萄球菌的96孔培养板。⑥将2个96孔培养板放入37℃恒温培养箱培养16～20h后，观察结果。
3.结果与讨论
3.1酪蛋白酸钠的标准曲线
在色谱条件为：流动相为乙腈：0.5 %乙酸水 （44：56）;检测波长为428 nm;流速为1 mL / min;柱温为35 ℃;进样体积为20 μL时，酪蛋白酸钠的标准曲线如下图所示：
3.2计算丹参酮-酪蛋白酸钠胶束的包藏率
由3次实验得到其吸光度值为：0.632，0.526，0.526。算出其吸光度平均值为0.561，带入上述标准曲线：
y（吸光度）=0.0084x（浓度）-0.032
得酪蛋白浓度为70.6微克每毫升，再乘以酪蛋白溶液用量120mL，得酪蛋白质量为8.47mg，最后除以丹参酮质量10mg，计算得其包封率为84.7%。
3.3酪蛋白纳米复合物的表征
下图三条曲线分别是0.05g/L的丹参酮溶液，1g/L的酪蛋白酸钠溶液和丹参酮-酪蛋白复合物溶液的紫外可见吸收光谱图。
由光谱图可知丹参酮在450mm处有一较大吸收峰，而包封后形成的丹参酮-NaC复合物在450mm处的吸收峰消失;因为游离的酪蛋白在275mm处存在吸收峰，故丹参酮-NaC复合物在此处存在一吸收峰。
所以上述内容表明实现了NaC对丹参酮的完全包封。
3.4用96孔板法测最小抑菌浓度
（1）下图为大肠杆菌96孔培养板培养结果：
由图可知：酪蛋白纳米复合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度是：12.5μg/ml。
（2）下图为金黄色葡萄球菌96孔培养板培养结果：
由图可知：酪蛋白纳米复合物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度是：6.25μg/ml。
4.结语
冠心病是一种终身性疾病，血管中的斑块一旦形成，很难彻底的消除，只能够通过长期用药稳定病情。然而，持续服用目前治疗冠心病的药物会对肝、肾等器官产生明显的危害。相比传统的治疗冠心病的药物，越来越多的天然生物活性分子因其低毒性，被认为是作为治疗冠心病的长期服用药物，最有希望的候选者。例如：丹参酮是从中药丹参中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，经临床试用证明治疗心绞痛效果显著，副作用小，为一治疗冠心病的新药，其有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等多方面作用，长期服用未见有明显副作用。但稳定性差，易受温度、pH及溶剂影响，发生不同程度的解离，影响药物效果。而找到有双亲性与自组装功能的包藏物是解决这一问题的有效方法。酪蛋白是一种两亲性大分子共聚物，能够发生自组装成为一种优良的包埋材料，具有良好的稳定性并且能与小分子和离子相结合，能够通过控制外部条件改变其结构和特性。其胶粒的两亲性和自组装特性有助于提高其稳定性。本文选用酪蛋白与丹参酮形成丹参酮-酪蛋白酸钠胶束复合物，并研究其性质与抑菌效果。
我们首先分别配置标准丹参酮、酪蛋白酸钠和PBS缓冲溶液，绘制酪蛋白酸钠的标准曲线。然后开始用酪蛋白包藏丹参酮并测其包封率，具体过程为：将容量瓶中的PBS溶液与酪蛋白酸钠溶液，用量筒分别量取50ml至烧杯中，用移液枪移取5ml的丹参酮乙醇溶液于烧杯中充分搅拌，并通过吸光度与标准曲线计算得出其包封率为84.7%。接着，我们进行了复合物的溶解度、表征、抑菌实验，具体步骤为：利用观察法与紫外分光光度计法对比丹参酮包封前与包封后的溶解度差异。测量紫外可见吸收光谱检测0.05g/L的丹参酮溶液，1g/L的酪蛋白酸钠溶液，和原先已配置的丹参酮-酪蛋白酸钠复合物溶液的光谱特性。并用用96孔板法并设置浓度梯度，测量最小抑菌浓度观察结果。
最后从中得出的结论是：由3次实验得到其吸光度，算出其吸光度平均值为0.561，带入标准曲线公式，得酪蛋白浓度为70.6微克每毫升，再乘以酪蛋白溶液用量120mL，得酪蛋白质量为8.47mg，最后除以丹参酮质量10mg，计算得其包封率为84.7%。由光谱图可知丹参酮在450mm处有一较大吸收峰，而包封后形成的丹参酮-NaC复合物在450mm处的吸收峰消失;因为游离的酪蛋白在275mm处存在吸收峰，故丹参酮-NaC复合物在此处存在一吸收峰。表明此实验实现了NaC对丹参酮的完全包封。由96孔板法测最小抑菌浓度结果得知：酪蛋白纳米复合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度是：12.5μg/ml，酪蛋白纳米复合物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度是：6.25μg/ml。
总之，针对像丹参酮一类的天然生物活性分子，使用酪蛋白纳米胶束对其进行较好的包藏，并且可以明显增加其稳定性。本文通过对：酪蛋白纳米胶束的构建及其对药物稳定性的影响的研究，不仅可以对冠心病的临床治疗上有所帮助，同时也可以为制药工程提供新的思路。
参考文献
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[2]杨源烈. 冠心病[EB/OL].http：//tag.120ask.com/jibing/gxb/1365249.html，2019-07-25
[3] 闫玉九. 冠心病的危害及治疗你知道多少[J]. 保健文汇，2019，第7期：117-117.
[4] 萨仁高娃. 乳酪蛋白胶束结构及其凝胶形成机制概述[EB/OL].https：//wenku.baidu.com/view/8626c4cae45c3b3567ec8bcc.html，2015-05-09.
作者简介：丁霁（2000-），女，北京人，本科在读，组长，主要从事生物工程等研究。
陈沅芷（2000-），女，江西南康人，本科在读，组员，主要从事生物工程等研究。
唐泽岩（2001-），男，河南郑州人，本科在读，组员，主要从事生物工程等研究。
王韬（2001-），男，山西太原人，本科在读，组员，主要从事生物工程等研究。
北京化工大学国际教育学院 北京 102299
【关键词】酪蛋白;丹参酮;纳米胶束;药物稳态;抑菌活性
Abstract：At present， more and more natural active small molecules have become the candidate drugs for clinical treatment of coronary heart disease. However， most of these natural drugs are insoluble and unstable in water， which limits their clinical application greatly. This project mainly explores the effects of casein nanomicelle encapsulation on tanshinone homeostasis. First， we used the self-assembly function of casein to encapsulate Tanshinone in casein to form nano-micelles. After the completion of encapsulation， the encapsulation rate and solubility of tanshinone-NAC complex were measured， and antibacterial activities were characterized and mapped. Finally， the conclusion was drawn that the construction of tanshinone -NaC nano-micellar complex significantly improved the stability of Tanshinone and provided new methods and ideas for future drug research.
Keywords： Casein; tanshinone; Micelle; Drug Stability; Bacteriostatic activity
1.绪论
1.1引文
冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病”。冠心病主要是由于冠状动脉出现多样硬化引起的，它是一种终身性疾病，血管中的斑块一旦形成，很难彻底的消除，我们只能够通过长期用药稳定病情。然而，持续服用目前治疗冠心病的药物会对肝、肾等器官产生明显的危害，甚至还会引起头疼、呕吐的情况;但是一旦停止药物，也将会引发非常严重的后果。
相比传统的治疗冠心病的药物，越来越多的天然生物活性分子因其低毒性，被认为是作为治疗冠心病的长期服用药物，最有希望的候选者。丹参酮（Salvia miltiorrhiza Bunge） 是从中药丹参（唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge根）中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，经临床试用证明治疗心绞痛效果显著，副作用小，为一治疗冠心病的新药。丹参酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等多方面作用，长期服用未见有明显副作用。但稳定性差，易受温度、pH及溶剂影响，发生不同程度的解离，影响药物效果。因此，开发新型有效的药物包藏系統势在必行。构建药物包藏系统的目的是增强药物的水溶性、稳定性，因此，药物的良好的生物相容性，会逐步展现出在癌症临床治疗中的巨大潜力。
酪蛋白是一种两亲性大分子共聚物，能够发生自组装成为一种优良的包埋材料，具有良好的稳定性并且能与小分子和离子相结合，能够通过控制外部条件改变其结构和特性。酪蛋白胶粒的两亲性和自组装特性有助于提高其稳定性。本项目探究酪蛋白纳米胶束对药物的稳态的影响，实验从以下几个方面开展工作：首先，利用酪蛋白自身的自组装特性将丹参酮包藏于酪蛋白中，形成丹参酮-NaC纳米胶束复合物并测量其包封率;其次，利用紫外分光光度计分别对游离的丹参酮、游离的酪蛋白及酪蛋白纳米复合物进行表征，并绘制出相应的紫外可见吸收光谱图;在包封完成后，测量纳米复合物的最小抑菌浓度，探究其生物活性，期望为冠心病的临床治疗做出一定的贡献。
1.2丹参酮
（1）理化性质。丹参酮，又名总丹参酮，是从中药丹参（唇形科植物丹参根）中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，从中分得丹参酮I、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、异隐丹参酮等10余个丹参酮单体，其中隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅱ，羟基丹参酮、丹参酸甲酯、丹参酮ⅡB 5个单体。
（2）生理功能。隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅱ，羟基丹参酮、丹参酸甲酯、丹参酮ⅡB 5个单体具有抗菌作用，且有抗炎、降温作用。丹参酮ⅡA的磺化产物丹参酮ⅡA磺酸钠能溶于水，经临床试用证明治疗心绞痛效果显著，副作用小，为一治疗冠心病的新药。丹参酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等多方面作用，长期服用未见有明显副作用。 1.3酪蛋白
（1）理化性质。纯酪蛋白为白色、无味、无臭的粒状固体。相对密度约1.26。不溶于水和有机溶剂。酪蛋白为非结晶、非吸潮性物质，常温下在水中可溶解0.8-1.2%，微溶于25℃水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分，当浸入水中则迅速膨胀，但分子不结合。
（2）酪蛋白纳米胶束。酪蛋白是一种两亲性大分子共聚物，能够发生自组装成为一种优良的包埋材料，具有良好的稳定性并且能与小分子和离子相结合，能够通过控制外部条件改变其结构和特性。其胶粒的两亲性和自组装特性有助于提高其稳定性。
1.4本选题研究的意义及主要内容
本选题研究的意义是：天然化合物丹参酮具有多种生理功能，其中，丹参酮治疗冠心病的效果和机制已经得到了广泛的报道和应用。然而，它存在着水溶性差、遇光热易分解、化学稳定度低、代谢快、半衰期短、难以被生物体吸收和利用等缺点。为了解决药物传递过程中药效降低和药物释放的难题，开发更加安全高效的药物递送系统迫在眉睫。
酪蛋白是一种两亲性大分子共聚物，能够发生自组装成为一种优良的包埋材料，具有良好的稳定性并且能与小分子和离子相结合，能够通过控制外部条件改变其结构和特性。其胶粒的两亲性和自组装特性有助于提高其稳定性。
本课题的主要内容是：选取酪蛋白酸钠包藏丹参酮，探究酪蛋白纳米胶束的包藏对药物的稳态的影响。首先，利用酪蛋白的自组装功能将丹参酮（tanshinone）包藏于酪蛋白中以形成纳米胶束。包封完成后，分别测量丹参酮-NaC复合物的包封率、绘制紫外可见吸收光谱以及储藏稳定性及抗菌活性研究。最后得出结论：丹参酮-NaC纳米胶束复合物的构建显著提高了丹参酮的储存稳定性，为将来药物研究提供了新的方法和思路。
2.纳米复合物的制备
2.1实验材料
丹参酮ⅡB、酪蛋白酸钠、95%乙醇、磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钾、胰蛋白胨、牛心浸出粉、氯化钠、葡萄糖
2.2实验仪器
电子天平、pH计、恒温水浴锅、磁力搅拌器、紫外分光光度计、红外光谱仪、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅
2.3实验方法
（1）配制丹参酮溶液。①计算丹参酮粉末的质量：50mL*1mg/mL=0.05克。②用电子天平称0.05克丹参酮于烧杯中，加少量95%乙醇溶解，然后倒入50毫升容量瓶里，分3次洗烧杯，将溶液全部倒入容量瓶里。③用95%乙醇稀释至刻度线，摇匀，即可得到50ml浓度为1mg/ml的丹参酮溶液。
（2）配制酪蛋白酸钠溶液。①分别计算酪蛋白酸钠粉末的质量为：0.5g、0.4g、0.3g、0.2g、0.1g。②用电子天平分别称取酪蛋白粉末于烧杯中，加少量水溶解，然后倒入50毫升容量瓶里，分3次洗烧杯，将溶液全部倒入容量瓶里。③用水稀释至刻度线，摇匀，即可得到50ml的5个不同浓度的溶液。
（3）配置100ml，pH为7.4的PBS溶液。①用电子天平称0.156克磷酸二氢钠、0.35814g十二水合磷酸氢二钾于烧杯中，加少量水溶解。②将其倒入100毫升容量瓶里，分3次洗烧杯，将溶液全部倒入容量瓶里。③用水稀释至刻度线，摇匀，即可得到100ml浓度为1mg/ml的pH为7.4的PBS溶液。
（4）绘制酪蛋白酸钠的标准曲线。①分别用乙醇配置浓度梯度为2、4、6、8、10 μg / mL 的酪蛋白酸钠标准溶液。②用高效液相色谱 （HPLC， LC-20A） 检测酪蛋白酸钠标准溶液。③在word中分别输入酪蛋白酸钠溶液浓度及其对应的吸光度，做其对应的吸光度与酪蛋白酸钠溶液浓度的趋势线，并求其回归方程。（色谱条件：流动相为乙腈：0.5 %乙酸水 （44：56）;检测波长为428 nm;流速为1 mL / min;柱温为35 ℃;进样体积为20 μL。）
（5）用酪蛋白酸钠包藏丹参酮。①将容量瓶中的PBS溶液与酪蛋白酸钠溶液用量筒分别量取50ml至烧杯中，用移液枪移取5ml的丹参酮乙醇溶液于试管中。②将烧杯放在磁力搅拌器中央位置，调整转速为600转，边搅拌边滴加丹参酮乙醇溶液于烧杯中。③静止烧杯于磁力搅拌器中央，搅拌2小时。
（6）测定丹参酮-酪蛋白酸钠胶束的包藏率。①取上述包藏完毕的混合液于离心管中，将离心管放入离心机中离心1h。②取上清液，用紫外分光光度计测其吸光度三次并记录。根据之前得出的酪蛋白酸钠的标准曲线计算出丹参酮的包藏质量，计算出参酮-酪蛋白酸钠胶束的包藏率。
（7）丹参酮溶解度的测定。①用去离子水配制500μg/mL的丹參酮-PBS混合液200mL。②将配制好的混合液于超声波溶解仪中超声20min以上，发现明显未溶固体。③改用无水乙醇配制500μg/mL的丹参酮-乙醇溶液，超声20min，未溶固体量减少。④用紫外分光光度计测上述丹参酮-乙醇溶液吸光度，确定其溶解情况。⑤其结果为0.161，数值较低。丹参酮在无水乙醇中溶解度较小，而在PBS溶液中明显难溶，表明丹参酮溶解性较差。
（8）酪蛋白纳米复合物的表征。采用紫外可见吸收光谱检测0.05g/L的丹参酮溶液，1g/L的酪蛋白酸钠溶液，和原先已配置的丹参酮-NaC复合物溶液的光谱特性。
（9）制备金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的菌悬液。①量取600ml水，按比例称取牛肉粉3g、氯化钠3g、蛋白胨6g，混合溶解，配得600ml培养液，分装到六个锥形瓶中。②锥形瓶加棉塞，瓶口用报纸包裹，并用麻绳扎好，防止灭菌时冷凝水浸润棉塞，用记号笔标记姓名日期。③检查灭菌锅水位险保证水位线高于最低水位。④将包好的三角烧瓶放入锅中。盖上锅盖，先拧紧盖，后拧紧螺栓。⑤打开排气阀并打开电源，设定温度120度开始加热，当锅内水温达到100度，等待几分钟。⑥灭菌时间到达后切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表压力为零时，打开排气阀，松开螺栓，打开盖子，取出培养皿。⑦取已制好灭菌过的培养基和培养皿。拆开包培养皿的报纸，点燃酒精灯，进行无菌操作，掀开报纸，取下棉塞。另一手抓住培养基底部，培养基口对火焰。左手大拇指和食指撑住皿盖。剩下三指托住皿底，在火焰旁打开皿盖。将培养基液体缓缓倒入培养皿中，静置，待其凝固后倒置。⑧待其凝固后，将金黄色葡萄球菌与大肠杆菌分别接种在牛肉膏蛋白胨平板上，保持37°C恒温培养24h，活化后用10ml无菌水配置成菌悬液。 （10）用96孔板法测最小抑菌浓度。①在96孔培养板所有实验孔中，分别加入空白肉汤100μL。②在96孔培养板第一排，分别加入25μg/m L的酪蛋白纳米复合物100μL，然后对药物进行二倍稀释，即第1孔中加入药液后用移液枪充分吹打（至少3次以上）使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μL加入第2孔，再充分吹打使之与肉汤充分混匀，同样吸取100μL加人第3孔中.照此重复直至最后一孔，吸取100μL弃去;此时每孔药物浓度从上到下依次为25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.390μg/ml，并在第二列與第三列设置平行实验。③在每一孔中加入稀释好的大肠杆菌悬液100μL，这样就形成测定一个药物最小抑菌浓度值的3次重复。此时每孔药物浓度即最终药物浓度，从上到下依次为25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.390μg/ml。④继续在每一孔中加入刃天青染液，区分抑菌效果。⑤重复上述步骤，再制作一个金黄色葡萄球菌的96孔培养板。⑥将2个96孔培养板放入37℃恒温培养箱培养16～20h后，观察结果。
3.结果与讨论
3.1酪蛋白酸钠的标准曲线
在色谱条件为：流动相为乙腈：0.5 %乙酸水 （44：56）;检测波长为428 nm;流速为1 mL / min;柱温为35 ℃;进样体积为20 μL时，酪蛋白酸钠的标准曲线如下图所示：
3.2计算丹参酮-酪蛋白酸钠胶束的包藏率
由3次实验得到其吸光度值为：0.632，0.526，0.526。算出其吸光度平均值为0.561，带入上述标准曲线：
y（吸光度）=0.0084x（浓度）-0.032
得酪蛋白浓度为70.6微克每毫升，再乘以酪蛋白溶液用量120mL，得酪蛋白质量为8.47mg，最后除以丹参酮质量10mg，计算得其包封率为84.7%。
3.3酪蛋白纳米复合物的表征
下图三条曲线分别是0.05g/L的丹参酮溶液，1g/L的酪蛋白酸钠溶液和丹参酮-酪蛋白复合物溶液的紫外可见吸收光谱图。
由光谱图可知丹参酮在450mm处有一较大吸收峰，而包封后形成的丹参酮-NaC复合物在450mm处的吸收峰消失;因为游离的酪蛋白在275mm处存在吸收峰，故丹参酮-NaC复合物在此处存在一吸收峰。
所以上述内容表明实现了NaC对丹参酮的完全包封。
3.4用96孔板法测最小抑菌浓度
（1）下图为大肠杆菌96孔培养板培养结果：
由图可知：酪蛋白纳米复合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度是：12.5μg/ml。
（2）下图为金黄色葡萄球菌96孔培养板培养结果：
由图可知：酪蛋白纳米复合物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度是：6.25μg/ml。
4.结语
冠心病是一种终身性疾病，血管中的斑块一旦形成，很难彻底的消除，只能够通过长期用药稳定病情。然而，持续服用目前治疗冠心病的药物会对肝、肾等器官产生明显的危害。相比传统的治疗冠心病的药物，越来越多的天然生物活性分子因其低毒性，被认为是作为治疗冠心病的长期服用药物，最有希望的候选者。例如：丹参酮是从中药丹参中提取的具有抑菌作用的脂溶性菲醌化合物，经临床试用证明治疗心绞痛效果显著，副作用小，为一治疗冠心病的新药，其有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等多方面作用，长期服用未见有明显副作用。但稳定性差，易受温度、pH及溶剂影响，发生不同程度的解离，影响药物效果。而找到有双亲性与自组装功能的包藏物是解决这一问题的有效方法。酪蛋白是一种两亲性大分子共聚物，能够发生自组装成为一种优良的包埋材料，具有良好的稳定性并且能与小分子和离子相结合，能够通过控制外部条件改变其结构和特性。其胶粒的两亲性和自组装特性有助于提高其稳定性。本文选用酪蛋白与丹参酮形成丹参酮-酪蛋白酸钠胶束复合物，并研究其性质与抑菌效果。
我们首先分别配置标准丹参酮、酪蛋白酸钠和PBS缓冲溶液，绘制酪蛋白酸钠的标准曲线。然后开始用酪蛋白包藏丹参酮并测其包封率，具体过程为：将容量瓶中的PBS溶液与酪蛋白酸钠溶液，用量筒分别量取50ml至烧杯中，用移液枪移取5ml的丹参酮乙醇溶液于烧杯中充分搅拌，并通过吸光度与标准曲线计算得出其包封率为84.7%。接着，我们进行了复合物的溶解度、表征、抑菌实验，具体步骤为：利用观察法与紫外分光光度计法对比丹参酮包封前与包封后的溶解度差异。测量紫外可见吸收光谱检测0.05g/L的丹参酮溶液，1g/L的酪蛋白酸钠溶液，和原先已配置的丹参酮-酪蛋白酸钠复合物溶液的光谱特性。并用用96孔板法并设置浓度梯度，测量最小抑菌浓度观察结果。
最后从中得出的结论是：由3次实验得到其吸光度，算出其吸光度平均值为0.561，带入标准曲线公式，得酪蛋白浓度为70.6微克每毫升，再乘以酪蛋白溶液用量120mL，得酪蛋白质量为8.47mg，最后除以丹参酮质量10mg，计算得其包封率为84.7%。由光谱图可知丹参酮在450mm处有一较大吸收峰，而包封后形成的丹参酮-NaC复合物在450mm处的吸收峰消失;因为游离的酪蛋白在275mm处存在吸收峰，故丹参酮-NaC复合物在此处存在一吸收峰。表明此实验实现了NaC对丹参酮的完全包封。由96孔板法测最小抑菌浓度结果得知：酪蛋白纳米复合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度是：12.5μg/ml，酪蛋白纳米复合物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度是：6.25μg/ml。
总之，针对像丹参酮一类的天然生物活性分子，使用酪蛋白纳米胶束对其进行较好的包藏，并且可以明显增加其稳定性。本文通过对：酪蛋白纳米胶束的构建及其对药物稳定性的影响的研究，不仅可以对冠心病的临床治疗上有所帮助，同时也可以为制药工程提供新的思路。
参考文献
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作者简介：丁霁（2000-），女，北京人，本科在读，组长，主要从事生物工程等研究。
陈沅芷（2000-），女，江西南康人，本科在读，组员，主要从事生物工程等研究。
唐泽岩（2001-），男，河南郑州人，本科在读，组员，主要从事生物工程等研究。
王韬（2001-），男，山西太原人，本科在读，组员，主要从事生物工程等研究。
北京化工大学国际教育学院 北京 102299