【摘 要】
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目的探讨高压氧协同靶向水通道蛋白-4(aquaporin 4,AQP-4)的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对改善脑创伤(trauma brain injury,TBI)大鼠认知功能的作用,并探讨其机制。方法将112只成年雄性SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、AQP-4 RNAi组、高压氧组和联合治疗组,每组28只。采用液压打击法建立大鼠TBI模型,构建靶向AQP-4
【机 构】
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山东第一医科大学附属济南人民医院(济南市人民医院)神经外科,济南 271199;济南市人民医院济南市神经肿瘤分子生物学重点实验室 271199,山东第一医科大学附属济南人民医院(济南市人民医院)急诊病
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目的探讨高压氧协同靶向水通道蛋白-4(aquaporin 4,AQP-4)的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对改善脑创伤(trauma brain injury,TBI)大鼠认知功能的作用,并探讨其机制。
方法将112只成年雄性SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、AQP-4 RNAi组、高压氧组和联合治疗组,每组28只。采用液压打击法建立大鼠TBI模型,构建靶向AQP-4的RNAi质粒;大鼠按照分组给予相应方式的干预后,于术后7 d、21 d对大鼠进行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS评分);术后21~25 d进行Morris水迷宫实验,记录大鼠目标象限停留时间百分比和每日逃避潜伏期;Evans蓝法测定血脑屏障通透性,干/湿比重法检测脑组织含水量;术后7 d用Western blot法检测AQP-4、半胱天冬酶-3 (caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达水平;RT-PCR法检测脑组织AQP-4的mRNA表达水平;TUNEL法及Annexin V法检测脑细胞凋亡率。采用SPSS 23.0及Graphpad Prism 7.0进行数据分析,组间多样本行单因素方差分析,Morris结果采用重复测量方差分析,两两比较用LSD-t检验。
结果mNSS评分结果显示,术后7 d,21 d,各组间mNSS评分差异有统计学意义(F=4.89,7.59,均P=0.01),各治疗组评分均低于对照组,以联合治疗组效果最理想(7 d:t=3.98,-7.75;21 d:t=47.82,7.94,均P<0.05)。Morris水迷宫实验结果显示,大鼠的目标象限停留时间和逃避潜伏期的时间及组别交互作用均不显著(F=1.83,8.42;均P>0.05),术后第24天和第25天,联合治疗组逃避潜伏期及目标象限停留时间百分比均好于其他各组(均P<0.05)。Evans蓝染色显示,AQP-4 RNAi组、高压氧组、联合治疗组Evans蓝含量均较对照组低(均P<0.05),联合治疗组最低(t=6.19,P<0.05)。干湿比重法结果显示,脑组织含水量以联合治疗组[(68.15±1.52)% ]最低(P<0.05),AQP-4 RNAi组[(76.71±1.06)% ]低于高压氧组[(80.23±1.43)%](t=4.38,P<0.05)。Western blot结果显示,联合治疗组AQP-4、Caspase-3、MMP-2,MMP-9蛋白表达明显低于其他组(均P<0.05),而Bcl-2表达增加(P<0.05)。RT-PCR结果(灰度值比)显示,AQP-4 RNAi组(0.61±0.21)、高压氧组(0.83±0.12)及联合治疗组(0.22±0.05)的AQP-4 mRNA水平与对照组(1.31±0.25)比,均差异有统计学意义(F=175.05,P<0.05),AQP-4 RNAi组优于高压氧组(t=5.25,P<0.05),以联合治疗组降低最明显(t=58.94,P<0.05)。TUNEL及Annexin V法检测结果显示,各治疗组较对照组均有效抑制神经细胞凋亡,尤以联合治疗组最为明显(P<0.01)。
结论靶向AQP-4 RNAi技术联合高压氧可有效促进认知功能损害的恢复,其机制可能与保护血脑屏障完整性、减轻TBI后脑水肿并抑制神经细胞凋亡有关。
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