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[摘 要]乳过氧化物酶具有天然抗菌活性，可以广泛应用到食品中，如乳制品、肉制品等，具有很好的抗菌作用。本文主要综述了分离乳过氧化物酶的盐析法、双水相萃取技术、膜分离技术以及色谱技术等。
中图分类号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）02-0339-02
[Abstract]Lactoperoxidase has a natural antibacterial activity， which could be widely applied to food and had good antimicrobial antiseptic effect， such as Dairy and meat products， etc. The paper mainly reviewed the separation and pufication technology of lactoperoxidase including ？salting-out method， ultrafiltration method， coupling aqueous two-phase technology and chromatography technology.
乳过氧化物酶（lactoperoxidase，简称LP）是过氧化物酶的一种，是存在于动物乳中的一种天然抗菌物质，常见于哺乳动物的乳腺、唾液腺、泪腺及其分泌物中[1]。乳过氧化物酶在食品行业中应用最广泛的是乳制品，还可将其应用到医药和肉制品行业中，具有较好的抑菌防腐效果。本文主要综述了分离乳过氧化物酶的盐析法、双水相萃取技术、膜分离技术以及色谱技术等。
1.盐析法
盐析沉淀法是酶分离纯化过程中最常用的方法，其原理是在高浓度的盐溶液条件下，大量盐离子使水分子浓度相对降低，蛋白质水合作用减弱，分子间相互凝聚沉淀析出，由于蛋白质水合作用与蛋白质本身的分子量、等电点等物理化学常数有关，所以在不同盐析条件下，不同种类的蛋白质发生聚集沉淀析出程度也不同，因而达到分离目的。盐析法具有操作方法简便、无需大型昂贵设备和成本低安全性高等特点，适用范围十分广泛。通常把硫酸钠、硫酸镁、柠檬酸钠、硫酸铵等用作盐析剂，国内有报道用硫酸铵盐析法分离大豆酸沉蛋白、羔羊皱胃酶和多管藻R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白。盐析法分离乳过氧化物酶还是较新的技术。
2.双水相萃取技术
双水相萃取体系是由两种聚合物或是一种聚合物和一种盐组成的，其原理是依据物质在两相间的具有选择性分配系数，当物质进入双水相体系后，由于生物分子量大小、电荷作用和各种力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境之间的相互影响作用，使物质在上相和下相中的分布状态不同（即分布浓度不同），形成双水相体系。提取某一物质，只需选择适宜的双水相体系，控制合适的条件（pH、双水相体系物质含量等），就可以得到适宜的分配系数，从而达到分离提取的目的[1]。与传统的提取方法比较来看，双水相萃取技术所使用的设备便捷、快速、经济，被分离物质在温和条件下进行快速分离，其获得产品的回收率和纯度较高。目前，双水相萃取技术已广泛地应用于蛋白质和核酸等生物活性产品的分离提取，并逐步走向工业化生产进程[2]。它为生物分子提供生物兼容的环境，具有连续操作空间，易于扩大生产的优点。国内有研究报道双水相法提取脂肪酶、糖化酶、淀粉酶等，但是没有应用双水相法提取乳过氧化物酶。利用双水相技术，优化提取牛乳中过氧化物酶提取的工艺条件，为双水相技术在乳过氧化物酶提取分离方面应用，提供基本的技术支撑，有很重要意义。
3.膜分离技术
膜分离技术是一项新兴的高新技术，具有能耗低、分离过程中物质不发生相变、操作简便、无二次污染、分离产物便于回收且分离效果佳等优点，已被广泛应用于工业中的产品分离、纯化等。常见的膜分离技术有微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜及离子交换膜[13]。膜分离技术已广泛的应用的乳品工业中，主要应用于乳清蛋白分离回收、乳清脱盐、除菌、酪蛋白浓缩、乳蛋白质分级分离等。膜技术主要是陶瓷膜技术分离酪蛋白和乳清蛋白以及超滤膜技术纯化乳过氧化物酶。
4.色谱分离
色谱分离技术又称层析技术分离，是一种用于分离成分复杂混合物中各个组分的有效方法。原理是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具备不同的分配系数，物质在两相体系作相对运动时，会随流动相一起运动，并在固相和流动相间进行多次反复的分配，从而使各物质达到分离纯化的目的。应用于乳过氧化物酶分离的色谱技术可分为离子交换层析、亲和层析、凝胶层析、吸附色谱和分配色谱等技术，此技术比较成熟，详细介绍一下。
4.1 离子交换层析分离技术
离子交换层析中，基质由带有电荷的树脂或纤维素构成，带有负电荷的为阳离子交换剂，反之为阴离子交换剂。离子交换色谱法分离蛋白质组分原理是依据不同蛋白质组分在一定条件的溶液中带有相应的电荷，根据蛋白质带电荷状态不同会与带相反电荷的离子交换剂的结合，按结合力的大小，在洗脱时从弱到强依次被洗脱下来而得以分离。
4.2 离子交换膜色谱提取乳过氧化物酶
Clovis K. Chiu等（1997）使用固定化磺酸根阳离子交换膜从乳清中分离乳过氧化物酶，此法优点是速度更快，相对于离子交换色谱柱，膜分离使用更小的尺寸；缺点是生产越多的目标物就需要越多的膜，增加生产成本，难以大量生产。Kerstin Plate等2006年提出了用带有阳离子的选择性吸附膜Sartobind S从生产酪蛋白所剩下的的乳清中来提取乳过氧化物酶，此法具有生产快的优点，适用于工业上大规模的生产。Linda Voswinkela等2011年提出使用阴阳离子交换膜色谱法（Sartobind Q and S nano），分两个步骤（先过阴离子交换膜未吸附物质再过阳离子交换膜）通过改变不同的缓冲液及pH值和洗脱液浓度从牛乳清中快速分离BSA，β-lactogloulin，ImmunoglobulinG，lactoperoxidase，lactoferrin多种蛋白，此法生产周期短，适用于工业生产。 4.3 免疫亲和层析（affinity chromatography）
将具有高度特异亲和性的二种物质之一以共价键形式结合到固定相，通过利用与固定相键合的物质具有不同程度的亲和性，将具有特异亲和性的物质成分与其他杂质分离的色谱法。1989年Bodil Langbakk等人使用一种免疫亲和色谱（配基结合免疫球蛋白G）从人乳中分离LP，其过程中LP和配基发生结合，利用含有2% SDS、pH 6.8和0.1 mol/L磷酸钠缓冲溶液，将乳过氧化物酶洗脱下来，从而分离纯化出纯度较高的乳过氧化物酶[3]。
4.4 凝胶层析
凝胶层析又称分子筛，按照分离纯化的物质是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，凝胶色谱又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。GFC主要是根据被分离样品中各组分分子质量大小的不同而进行分离洗脱的一项高效的色谱技术。1963年Peter Z首先使用离子交换色谱从牛乳中分离出LP，之后使用凝胶色谱进一步纯化分离得到纯度较高的LP[4]。2011年，Y. Morita等人以牛奶碱性蛋白为原料，将碱性蛋白溶解于磷酸钠缓冲溶液，先使用SP-Sepharose填料平衡分离，并用0-1.5M NaCl进行洗脱，将所得分离物质收集再使用HiLoad 16/60 Superdex 75 pg进一步纯化得到高回收率的乳过氧化物酶。
参考文献：
[1] 徐长波，王巍杰.双水相萃取技术研究进展[J].化学技术与开发，2009，38（5）：40-44.
[2] 范芳.双水相萃取技术的应用进展[J].化学与生物工程，2011，28（7）：16-20.
[3] Bodil Langbakk，Torgeir Flatmark.Demonstration and partial purification ofLactoperoxidase from human colostrum[J].Biochem J，1984，174：300-304.
[4] Peter Z，Allen.Lactoperoxidase. IV. Immunological analysis of bovine lactoperoxidase preparations obtained by a simplified fractionation procedure[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1963，102（1）：106-113.
中图分类号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）02-0339-02
[Abstract]Lactoperoxidase has a natural antibacterial activity， which could be widely applied to food and had good antimicrobial antiseptic effect， such as Dairy and meat products， etc. The paper mainly reviewed the separation and pufication technology of lactoperoxidase including ？salting-out method， ultrafiltration method， coupling aqueous two-phase technology and chromatography technology.
乳过氧化物酶（lactoperoxidase，简称LP）是过氧化物酶的一种，是存在于动物乳中的一种天然抗菌物质，常见于哺乳动物的乳腺、唾液腺、泪腺及其分泌物中[1]。乳过氧化物酶在食品行业中应用最广泛的是乳制品，还可将其应用到医药和肉制品行业中，具有较好的抑菌防腐效果。本文主要综述了分离乳过氧化物酶的盐析法、双水相萃取技术、膜分离技术以及色谱技术等。
1.盐析法
盐析沉淀法是酶分离纯化过程中最常用的方法，其原理是在高浓度的盐溶液条件下，大量盐离子使水分子浓度相对降低，蛋白质水合作用减弱，分子间相互凝聚沉淀析出，由于蛋白质水合作用与蛋白质本身的分子量、等电点等物理化学常数有关，所以在不同盐析条件下，不同种类的蛋白质发生聚集沉淀析出程度也不同，因而达到分离目的。盐析法具有操作方法简便、无需大型昂贵设备和成本低安全性高等特点，适用范围十分广泛。通常把硫酸钠、硫酸镁、柠檬酸钠、硫酸铵等用作盐析剂，国内有报道用硫酸铵盐析法分离大豆酸沉蛋白、羔羊皱胃酶和多管藻R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白。盐析法分离乳过氧化物酶还是较新的技术。
2.双水相萃取技术
双水相萃取体系是由两种聚合物或是一种聚合物和一种盐组成的，其原理是依据物质在两相间的具有选择性分配系数，当物质进入双水相体系后，由于生物分子量大小、电荷作用和各种力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境之间的相互影响作用，使物质在上相和下相中的分布状态不同（即分布浓度不同），形成双水相体系。提取某一物质，只需选择适宜的双水相体系，控制合适的条件（pH、双水相体系物质含量等），就可以得到适宜的分配系数，从而达到分离提取的目的[1]。与传统的提取方法比较来看，双水相萃取技术所使用的设备便捷、快速、经济，被分离物质在温和条件下进行快速分离，其获得产品的回收率和纯度较高。目前，双水相萃取技术已广泛地应用于蛋白质和核酸等生物活性产品的分离提取，并逐步走向工业化生产进程[2]。它为生物分子提供生物兼容的环境，具有连续操作空间，易于扩大生产的优点。国内有研究报道双水相法提取脂肪酶、糖化酶、淀粉酶等，但是没有应用双水相法提取乳过氧化物酶。利用双水相技术，优化提取牛乳中过氧化物酶提取的工艺条件，为双水相技术在乳过氧化物酶提取分离方面应用，提供基本的技术支撑，有很重要意义。
3.膜分离技术
膜分离技术是一项新兴的高新技术，具有能耗低、分离过程中物质不发生相变、操作简便、无二次污染、分离产物便于回收且分离效果佳等优点，已被广泛应用于工业中的产品分离、纯化等。常见的膜分离技术有微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜及离子交换膜[13]。膜分离技术已广泛的应用的乳品工业中，主要应用于乳清蛋白分离回收、乳清脱盐、除菌、酪蛋白浓缩、乳蛋白质分级分离等。膜技术主要是陶瓷膜技术分离酪蛋白和乳清蛋白以及超滤膜技术纯化乳过氧化物酶。
4.色谱分离
色谱分离技术又称层析技术分离，是一种用于分离成分复杂混合物中各个组分的有效方法。原理是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具备不同的分配系数，物质在两相体系作相对运动时，会随流动相一起运动，并在固相和流动相间进行多次反复的分配，从而使各物质达到分离纯化的目的。应用于乳过氧化物酶分离的色谱技术可分为离子交换层析、亲和层析、凝胶层析、吸附色谱和分配色谱等技术，此技术比较成熟，详细介绍一下。
4.1 离子交换层析分离技术
离子交换层析中，基质由带有电荷的树脂或纤维素构成，带有负电荷的为阳离子交换剂，反之为阴离子交换剂。离子交换色谱法分离蛋白质组分原理是依据不同蛋白质组分在一定条件的溶液中带有相应的电荷，根据蛋白质带电荷状态不同会与带相反电荷的离子交换剂的结合，按结合力的大小，在洗脱时从弱到强依次被洗脱下来而得以分离。
4.2 离子交换膜色谱提取乳过氧化物酶
Clovis K. Chiu等（1997）使用固定化磺酸根阳离子交换膜从乳清中分离乳过氧化物酶，此法优点是速度更快，相对于离子交换色谱柱，膜分离使用更小的尺寸；缺点是生产越多的目标物就需要越多的膜，增加生产成本，难以大量生产。Kerstin Plate等2006年提出了用带有阳离子的选择性吸附膜Sartobind S从生产酪蛋白所剩下的的乳清中来提取乳过氧化物酶，此法具有生产快的优点，适用于工业上大规模的生产。Linda Voswinkela等2011年提出使用阴阳离子交换膜色谱法（Sartobind Q and S nano），分两个步骤（先过阴离子交换膜未吸附物质再过阳离子交换膜）通过改变不同的缓冲液及pH值和洗脱液浓度从牛乳清中快速分离BSA，β-lactogloulin，ImmunoglobulinG，lactoperoxidase，lactoferrin多种蛋白，此法生产周期短，适用于工业生产。 4.3 免疫亲和层析（affinity chromatography）
将具有高度特异亲和性的二种物质之一以共价键形式结合到固定相，通过利用与固定相键合的物质具有不同程度的亲和性，将具有特异亲和性的物质成分与其他杂质分离的色谱法。1989年Bodil Langbakk等人使用一种免疫亲和色谱（配基结合免疫球蛋白G）从人乳中分离LP，其过程中LP和配基发生结合，利用含有2% SDS、pH 6.8和0.1 mol/L磷酸钠缓冲溶液，将乳过氧化物酶洗脱下来，从而分离纯化出纯度较高的乳过氧化物酶[3]。
4.4 凝胶层析
凝胶层析又称分子筛，按照分离纯化的物质是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，凝胶色谱又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。GFC主要是根据被分离样品中各组分分子质量大小的不同而进行分离洗脱的一项高效的色谱技术。1963年Peter Z首先使用离子交换色谱从牛乳中分离出LP，之后使用凝胶色谱进一步纯化分离得到纯度较高的LP[4]。2011年，Y. Morita等人以牛奶碱性蛋白为原料，将碱性蛋白溶解于磷酸钠缓冲溶液，先使用SP-Sepharose填料平衡分离，并用0-1.5M NaCl进行洗脱，将所得分离物质收集再使用HiLoad 16/60 Superdex 75 pg进一步纯化得到高回收率的乳过氧化物酶。
参考文献：
[1] 徐长波，王巍杰.双水相萃取技术研究进展[J].化学技术与开发，2009，38（5）：40-44.
[2] 范芳.双水相萃取技术的应用进展[J].化学与生物工程，2011，28（7）：16-20.
[3] Bodil Langbakk，Torgeir Flatmark.Demonstration and partial purification ofLactoperoxidase from human colostrum[J].Biochem J，1984，174：300-304.
[4] Peter Z，Allen.Lactoperoxidase. IV. Immunological analysis of bovine lactoperoxidase preparations obtained by a simplified fractionation procedure[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1963，102（1）：106-113.