论文部分内容阅读
[摘要] 本文采用提取黄酮类物质的最佳条件提取柑橘叶中总黄酮：总提取时间3小时，乙醇浓度80%，浸提温度80摄℃，料液比1:30 浸提两次。利用黄酮与FeCl3、H2SO4（18.4mol·L-1）等试剂的特征反应对所得提取物进行定性分析，确定了柑橘叶所提取物中含有黄酮类物质。用紫外分光光度法以芦丁为对照品，对其进行配位显色反应，在最大吸收峰510nm处测定提取物中总黄酮含量为0.01464%。标准曲线方程为Y=9.2113X-0.0018（r=0.9999）。
[关键词] 柑橘叶 黄酮 紫外分光光度法
引言
黄酮类化合物已引起了人们的广泛重视，因为它分布于植物界，绝大多数植物都能合成黄酮类化合物，主要包括：黄酮类，黄酮醇类，异黄酮类，黄烷酮类，异黄烷酮类等。在自然界植物中绝大多数黄酮类化合物以苷形式存在，少数以游离苷存在。黄酮类化合物的生理功能多种多样，不同的黄酮化合物具有不同的生物活性，主要的生理活性有:维生素P样作用，抗菌作用，抑制癌细胞的生长或抗癌作用，解痉挛作用,降低血压作用，女性激素样作用，抑制胆碱脂酶作用，扩张冠状动脉的作用等[1-2]。还有大量研究表明黄酮类化合物有降血脂，止血，镇咳祛痰，降低血管脆性，抑制血小板聚集等多种药理作用。
目前有一些研究者对柑橘皮、果实中黄酮类化合物进行了研究[3]，对于柑橘叶的研究尚未有文献报道，柑橘叶的原料来源丰富而且廉价本实验就采用传统的最佳提取工艺来提取柑橘叶中的黄酮。
1.实验部分
1.1 实验材料、试剂和仪器
1.1.1 实验材料和试剂
新鲜柑橘叶 （绵阳游仙区）； 芦丁标准品 （中国药品生物制品检定所）；无水乙醇；95 % 乙醇 ； 石油醚； 乙酸乙酯 ；NaNO2 ； Al(NO3)3 ； NaOH （ 成都市联合化工试剂研究所，均为AR）。
1.1.2 实验仪器
紫外分光光度计（UV-2401PC日本岛津公司）； DZKW- 恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂）。
1.2 实验方法
1.2.1 提取原理
根据相似相溶原理，对所用溶剂按黄酮类化合物的极性来选择，柑橘叶中所含的有效活性物质主要为黄酮甙类，具有较大的极性和亲水性，故可以选择热水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂进行浸提。但由于水的极性过大，且易于将蛋白质、糖类的易溶于水的成分浸提出来，且水提法提取物存放易发霉，从而影响黄酮类化合物的提取和分离；甲醇具有较大的毒理性，不易用于生产；乙醇、丙酮克服了水提取法存在的缺点，丙酮极性小，提取率比水提取法高，过滤等操作较容易，但价格昂贵；乙醇极性较小，含有羟基，80 %乙醇水溶液既可提取黄酮苷元又能提取黄酮苷，故提取率高，随温度上升提取率有所提高，但80ºC以后提取率上升不明显[4]，且乙醇提取液的过滤，溶剂回收，干燥等过程容易进行。蛋白质、糖类等杂质在乙醇中不溶或难溶，本实验选用较经济的，80 %乙醇水溶液作为浸提及洗脱溶剂。
1.2.2 分离纯化
（1）石油醚萃取 用石油醚萃取乙醇浸提液，以除去叶绿素等酯溶性色素，最终达到防止其对实验结果的干扰。
（2）乙酸乙酯萃取 取以上萃取液乙醇层，在90ºC水浴挥至膏状。并用10 mL乙酸乙酯溶解三次合并乙酸乙酯溶解液，再用30 mL蒸馏水洗涤三次，水层均弃去。
1.2.3 实验方法
新鲜柑橘叶烘干（50ºC）→ 过筛（40目）→打碎 →浸提 → 抽滤 → 石油醚萃取 → 挥干乙醇层 → 乙酸乙酯溶解 → 水洗 →乙醇洗脱 → 浓缩定容 → 测定吸光度值 → 分析实验结果[5-10]。具体实验操作如下：
1）摘取新鲜柑橘叶，并用烘干箱在40ºC左右烘干并用食品破碎机破碎至40目，备用：
2）准确称取柑橘叶粉10g，按最优提取工艺提取。
3）将提取液抽滤在85ºC左右回流浓缩，用石油醚萃取三次，再用蒸馏水洗。
4）再用恒温水浴锅浓缩用30 %乙醇定容至50mL待测。
1.3 芦丁标准曲线的绘制和样品吸光度测定
1.3.1 标准曲线的绘制
准确称取12.8mg芦丁标准品到小烧杯中，加入少量纯水，水浴加热使之部分溶解，将溶液转移入100mL 容量瓶中。剩余在小烧杯中的固体继续加水溶解，并转移到容量瓶中。重复此步骤，直到所有芦丁均转移至容量瓶中。将容量瓶置于水浴中加热，直到溶液完全澄清为止。冷却后，定容100mL，即得12.8mg/100mL的芦丁标准液。
分别吸取上述芦丁标准液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于25 mL比色管中，用30 %的乙醇补充至12.5 mL摇匀，加入0.7 mL 5 %的亚硝酸钠溶液摇匀，静置5min 后加入0.7mL10 % 硝酸铝摇匀并静置6min 后，再加入5 mL 1 mol·L-1的 NaOH，摇匀并用30 %的乙醇定容至刻度后，摇匀后静置10min 后，于波长510 nm处比色测定各样品液吸光度，试剂空白为参比液，其数据如表1所示。
图1芦丁浓度与吸光度
将表1数据，以吸光度为纵坐标，以芦丁标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性回归分析得标准回归方程为：
Y=9.2113X-0.0018
提取液浓度（g·L-1）X=(Y+0.0018)/9.2113
总黄酮得率（%） = (X×V/ W×1000)×100%
V--样液定容后的体积
W-称取样品竹叶粉重量
1.3.2 样品吸光度的测定
吸取所得样液 2 mL于25 mL比色管中，按上述芦丁标准曲线绘制方法配制溶液，并以空白为参比液，测取其吸光度。
2.提取物定性鉴定
2.1 紫外光谱分析
黄酮类化合物大都具有C6-C3-C6的基本结构，这一结构特点使大多数黄酮类化合物的紫外光谱在240 nm～400 nm有两个吸收峰，分别在主要由B 环取代基性质决定的带Ⅰ（320 nm～380 nm）和主要由A环取代基性质决定的带Ⅱ(240 nm～ 270 nm)两个区域出现。芦丁标准溶液在经过加入NaNO2、Al(NO3)3、NaOH显色处理后带Ⅰ和带Ⅱ分别转移至450 nm～510 nm和415nm ～470 nm处；而所得样品图谱（如图2）在510 nm左右有吸收峰基本与其相似[11-13]。
本文进行柑橘叶总黄酮提取实验后，用紫外分光光度法进行柑橘叶提取物液中黄酮含量测定时发现，按照紫外分光光度法进行测定，试液中会出现红色絮状的漂浮物，据文献[14-15]报道，本文认为这种现象极可能是树叶中普遍含有的干扰性原花色素类杂质造成的原花色素类物质能够在碱性环境下与铝离子形成络和物沉淀造成的。
图2 柑橘叶提取物的紫外吸收光谱图
图3 芦丁的紫外吸收光谱图
2.2 显色反应
黄酮类化合物在其基本碳架上含有碱性氧原子，而绝大多数都是带有酚性羟基的衍生物，因而能与某些金属离子产生络合反应和与某些较强的还原剂发生颜色反应。因此可以黄酮类化合物的这一特性对其进行定性鉴定[2]。取1mL样液置于试管中，分别加入中性醋酸铅、浓硫酸、硼酸等试剂，摇匀后静置一段时间，观察到其颜色反应如表2所示。
上述颜色反应，基本符合黄酮类化合物的特征颜色反应；再对照紫外光谱谱线，可以确认所得样品主要组分含有黄酮类物质。
3.结果与讨论
3.1 由芦丁的标准曲线方程得柑橘叶总黄酮吸光度与产率如表3所示。
由表3中可以清楚的看出，由芦丁的标准曲线方程得柑橘叶总黄酮的产率较低。其原因是：
（1）文献表明柑橘中黄酮类物质大多数分布在果皮和果实中,柑橘叶中的总黄酮含量要相对较少些。
（2）本实验在对提取液进行了简单的分离纯化，未采用较优的纯化方法如柱层析法、薄层析法、纸层析法等，使提取的总黄酮中还含有其他物质。
（3）柑橘叶总黄酮的含量取平均值仅有0.01464%，较柑橘皮、果实都低。但柑橘叶的原料丰富，而且材料廉价，使柑橘叶具有一定的研究价值。
3.2 由图2和图3可以看出黄酮类化合物的最大吸收峰在510 nm左右。图2 柑橘叶提取物的紫外吸收光谱图中在660 nm左右有吸收峰，查阅文献可知叶绿素的吸收峰663 nm左右，所以柑橘叶总黄酮的提取液中很有可能含有叶绿素，在进行分离纯化时没有将它完全除去造成对实验的影响。在400 nm左右的吸收峰可能是A环取代基性质决定的带Ⅱ在(240nm～270 nm)区域出现，经过加入NaNO2、Al(NO3)3、NaOH显色处理后带Ⅱ转移415nm ～470 nm带Ⅰ转移至450 nm ～510 nm处，所以图2柑橘叶提取物的紫外吸收光谱在500 nm左右出现吸收峰。
4.结论
（1）通过实验确定柑橘叶中含有黄酮类物质，本文中提取的总黄酮含量为0.01464%。
（2）柑橘叶物美价廉，它的总黄酮的研究是一个非常有前景的科学课题，柑橘叶也是个非常有价值的药、食、用资源。
参考文献：
[1]赵晓莉,岳红.黄酮化合物分析方法概述[J].盐湖研究，2005，13（2）：34-35.
[2]高智强,江相兰，宋仲容.竹叶中黄酮类化合物的研究进展评述[J].西南民族大学学报.自然科学版，2005，31（1）：38-39.
[3]杨洋,陈朝勇,韦小英,李秋庭.竹叶黄酮的提取和纯化工艺研究[J] . 食品科技2005,11( 9 ):32-35.
[4]刘江刍鸟 ，周荣琪.竹叶提取物总黄酮含量测定方法的改进[J].食品科技，2005,10（5）89-95.
[5]Li HY,Sun JY, Dai SW.Studies on Chemical Constituents in Leaf of Phyllostachys PubescebsJ.U. S CHINESE HEAL THAND H YGIENE JOU RNAS2003,6(4):7.
[6]彭秧锡.竹叶中总黄酮提取工艺研究.武汉理工大学学报[J]，2005，27（12）：39-41.
[7]王振宇，杨春榆，金钟跃.超声波提取芦荟凝胶定工艺[J].东北林业大学学报，2002，30（4）：19-21.
[8]刘振南.用正交法探讨山楂叶中黄酮类化合物的乙醇提取工艺[J].广西民族学院学报（自然科学报），1999，5（3）：27-28.
[9]李秀信，刘青利，张院民等.香椿叶总黄酮提取方法研究[J].西北林学院院报，2002，17（1）：68-69.
[10]Massaelli H Z,Sobrattee S,Pierce G N,The importance of Lipid solubility in antioxidant and tyee radical generating system for determing lipaprotein peroxidation [J]Free Radical Biology Medicinc.1999,(26):1524-1530.
[11]田金河,曾庆孝,杨程芳.不同显色方法测定绿豆壳中黄酮含量的比较研究[J].粮油加工与食品机械,2003,(11).：64-67.
[12]张延志，候镜德.苦竹叶中黄酮类化合物的液相色谱-质谱联用分析[J].宁波高等专科学校学报，2001，13：89-92.
[13]张延志，候镜德.高效液相色谱法测定苦竹叶中总黄酮[J].宁波高等专科学校学报1996，18（1）：199-200.
[14]陈云龙，谢笔钧，胡慰望.HPLC和UV 测定银杏叶提取物中总黄酮糖苷含量的研究[J].中国药学杂质，1997，32（增）：28-30.
[15] 曾凡骏，陈松波，曾里等.一种改进的银杏黄酮紫外分光光度检测方法的研究[J].食品科学，2003，24（11）：102-104.
作者简介：
刘晓燕：（1965.1—），女，副教授，现任教于绵阳师范学院化学与化学工程学院，主要研究方向：无机化学和环境化学。
[关键词] 柑橘叶 黄酮 紫外分光光度法
引言
黄酮类化合物已引起了人们的广泛重视，因为它分布于植物界，绝大多数植物都能合成黄酮类化合物，主要包括：黄酮类，黄酮醇类，异黄酮类，黄烷酮类，异黄烷酮类等。在自然界植物中绝大多数黄酮类化合物以苷形式存在，少数以游离苷存在。黄酮类化合物的生理功能多种多样，不同的黄酮化合物具有不同的生物活性，主要的生理活性有:维生素P样作用，抗菌作用，抑制癌细胞的生长或抗癌作用，解痉挛作用,降低血压作用，女性激素样作用，抑制胆碱脂酶作用，扩张冠状动脉的作用等[1-2]。还有大量研究表明黄酮类化合物有降血脂，止血，镇咳祛痰，降低血管脆性，抑制血小板聚集等多种药理作用。
目前有一些研究者对柑橘皮、果实中黄酮类化合物进行了研究[3]，对于柑橘叶的研究尚未有文献报道，柑橘叶的原料来源丰富而且廉价本实验就采用传统的最佳提取工艺来提取柑橘叶中的黄酮。
1.实验部分
1.1 实验材料、试剂和仪器
1.1.1 实验材料和试剂
新鲜柑橘叶 （绵阳游仙区）； 芦丁标准品 （中国药品生物制品检定所）；无水乙醇；95 % 乙醇 ； 石油醚； 乙酸乙酯 ；NaNO2 ； Al(NO3)3 ； NaOH （ 成都市联合化工试剂研究所，均为AR）。
1.1.2 实验仪器
紫外分光光度计（UV-2401PC日本岛津公司）； DZKW- 恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂）。
1.2 实验方法
1.2.1 提取原理
根据相似相溶原理，对所用溶剂按黄酮类化合物的极性来选择，柑橘叶中所含的有效活性物质主要为黄酮甙类，具有较大的极性和亲水性，故可以选择热水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂进行浸提。但由于水的极性过大，且易于将蛋白质、糖类的易溶于水的成分浸提出来，且水提法提取物存放易发霉，从而影响黄酮类化合物的提取和分离；甲醇具有较大的毒理性，不易用于生产；乙醇、丙酮克服了水提取法存在的缺点，丙酮极性小，提取率比水提取法高，过滤等操作较容易，但价格昂贵；乙醇极性较小，含有羟基，80 %乙醇水溶液既可提取黄酮苷元又能提取黄酮苷，故提取率高，随温度上升提取率有所提高，但80ºC以后提取率上升不明显[4]，且乙醇提取液的过滤，溶剂回收，干燥等过程容易进行。蛋白质、糖类等杂质在乙醇中不溶或难溶，本实验选用较经济的，80 %乙醇水溶液作为浸提及洗脱溶剂。
1.2.2 分离纯化
（1）石油醚萃取 用石油醚萃取乙醇浸提液，以除去叶绿素等酯溶性色素，最终达到防止其对实验结果的干扰。
（2）乙酸乙酯萃取 取以上萃取液乙醇层，在90ºC水浴挥至膏状。并用10 mL乙酸乙酯溶解三次合并乙酸乙酯溶解液，再用30 mL蒸馏水洗涤三次，水层均弃去。
1.2.3 实验方法
新鲜柑橘叶烘干（50ºC）→ 过筛（40目）→打碎 →浸提 → 抽滤 → 石油醚萃取 → 挥干乙醇层 → 乙酸乙酯溶解 → 水洗 →乙醇洗脱 → 浓缩定容 → 测定吸光度值 → 分析实验结果[5-10]。具体实验操作如下：
1）摘取新鲜柑橘叶，并用烘干箱在40ºC左右烘干并用食品破碎机破碎至40目，备用：
2）准确称取柑橘叶粉10g，按最优提取工艺提取。
3）将提取液抽滤在85ºC左右回流浓缩，用石油醚萃取三次，再用蒸馏水洗。
4）再用恒温水浴锅浓缩用30 %乙醇定容至50mL待测。
1.3 芦丁标准曲线的绘制和样品吸光度测定
1.3.1 标准曲线的绘制
准确称取12.8mg芦丁标准品到小烧杯中，加入少量纯水，水浴加热使之部分溶解，将溶液转移入100mL 容量瓶中。剩余在小烧杯中的固体继续加水溶解，并转移到容量瓶中。重复此步骤，直到所有芦丁均转移至容量瓶中。将容量瓶置于水浴中加热，直到溶液完全澄清为止。冷却后，定容100mL，即得12.8mg/100mL的芦丁标准液。
分别吸取上述芦丁标准液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于25 mL比色管中，用30 %的乙醇补充至12.5 mL摇匀，加入0.7 mL 5 %的亚硝酸钠溶液摇匀，静置5min 后加入0.7mL10 % 硝酸铝摇匀并静置6min 后，再加入5 mL 1 mol·L-1的 NaOH，摇匀并用30 %的乙醇定容至刻度后，摇匀后静置10min 后，于波长510 nm处比色测定各样品液吸光度，试剂空白为参比液，其数据如表1所示。
图1芦丁浓度与吸光度
将表1数据，以吸光度为纵坐标，以芦丁标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性回归分析得标准回归方程为：
Y=9.2113X-0.0018
提取液浓度（g·L-1）X=(Y+0.0018)/9.2113
总黄酮得率（%） = (X×V/ W×1000)×100%
V--样液定容后的体积
W-称取样品竹叶粉重量
1.3.2 样品吸光度的测定
吸取所得样液 2 mL于25 mL比色管中，按上述芦丁标准曲线绘制方法配制溶液，并以空白为参比液，测取其吸光度。
2.提取物定性鉴定
2.1 紫外光谱分析
黄酮类化合物大都具有C6-C3-C6的基本结构，这一结构特点使大多数黄酮类化合物的紫外光谱在240 nm～400 nm有两个吸收峰，分别在主要由B 环取代基性质决定的带Ⅰ（320 nm～380 nm）和主要由A环取代基性质决定的带Ⅱ(240 nm～ 270 nm)两个区域出现。芦丁标准溶液在经过加入NaNO2、Al(NO3)3、NaOH显色处理后带Ⅰ和带Ⅱ分别转移至450 nm～510 nm和415nm ～470 nm处；而所得样品图谱（如图2）在510 nm左右有吸收峰基本与其相似[11-13]。
本文进行柑橘叶总黄酮提取实验后，用紫外分光光度法进行柑橘叶提取物液中黄酮含量测定时发现，按照紫外分光光度法进行测定，试液中会出现红色絮状的漂浮物，据文献[14-15]报道，本文认为这种现象极可能是树叶中普遍含有的干扰性原花色素类杂质造成的原花色素类物质能够在碱性环境下与铝离子形成络和物沉淀造成的。
图2 柑橘叶提取物的紫外吸收光谱图
图3 芦丁的紫外吸收光谱图
2.2 显色反应
黄酮类化合物在其基本碳架上含有碱性氧原子，而绝大多数都是带有酚性羟基的衍生物，因而能与某些金属离子产生络合反应和与某些较强的还原剂发生颜色反应。因此可以黄酮类化合物的这一特性对其进行定性鉴定[2]。取1mL样液置于试管中，分别加入中性醋酸铅、浓硫酸、硼酸等试剂，摇匀后静置一段时间，观察到其颜色反应如表2所示。
上述颜色反应，基本符合黄酮类化合物的特征颜色反应；再对照紫外光谱谱线，可以确认所得样品主要组分含有黄酮类物质。
3.结果与讨论
3.1 由芦丁的标准曲线方程得柑橘叶总黄酮吸光度与产率如表3所示。
由表3中可以清楚的看出，由芦丁的标准曲线方程得柑橘叶总黄酮的产率较低。其原因是：
（1）文献表明柑橘中黄酮类物质大多数分布在果皮和果实中,柑橘叶中的总黄酮含量要相对较少些。
（2）本实验在对提取液进行了简单的分离纯化，未采用较优的纯化方法如柱层析法、薄层析法、纸层析法等，使提取的总黄酮中还含有其他物质。
（3）柑橘叶总黄酮的含量取平均值仅有0.01464%，较柑橘皮、果实都低。但柑橘叶的原料丰富，而且材料廉价，使柑橘叶具有一定的研究价值。
3.2 由图2和图3可以看出黄酮类化合物的最大吸收峰在510 nm左右。图2 柑橘叶提取物的紫外吸收光谱图中在660 nm左右有吸收峰，查阅文献可知叶绿素的吸收峰663 nm左右，所以柑橘叶总黄酮的提取液中很有可能含有叶绿素，在进行分离纯化时没有将它完全除去造成对实验的影响。在400 nm左右的吸收峰可能是A环取代基性质决定的带Ⅱ在(240nm～270 nm)区域出现，经过加入NaNO2、Al(NO3)3、NaOH显色处理后带Ⅱ转移415nm ～470 nm带Ⅰ转移至450 nm ～510 nm处，所以图2柑橘叶提取物的紫外吸收光谱在500 nm左右出现吸收峰。
4.结论
（1）通过实验确定柑橘叶中含有黄酮类物质，本文中提取的总黄酮含量为0.01464%。
（2）柑橘叶物美价廉，它的总黄酮的研究是一个非常有前景的科学课题，柑橘叶也是个非常有价值的药、食、用资源。
参考文献：
[1]赵晓莉,岳红.黄酮化合物分析方法概述[J].盐湖研究，2005，13（2）：34-35.
[2]高智强,江相兰，宋仲容.竹叶中黄酮类化合物的研究进展评述[J].西南民族大学学报.自然科学版，2005，31（1）：38-39.
[3]杨洋,陈朝勇,韦小英,李秋庭.竹叶黄酮的提取和纯化工艺研究[J] . 食品科技2005,11( 9 ):32-35.
[4]刘江刍鸟 ，周荣琪.竹叶提取物总黄酮含量测定方法的改进[J].食品科技，2005,10（5）89-95.
[5]Li HY,Sun JY, Dai SW.Studies on Chemical Constituents in Leaf of Phyllostachys PubescebsJ.U. S CHINESE HEAL THAND H YGIENE JOU RNAS2003,6(4):7.
[6]彭秧锡.竹叶中总黄酮提取工艺研究.武汉理工大学学报[J]，2005，27（12）：39-41.
[7]王振宇，杨春榆，金钟跃.超声波提取芦荟凝胶定工艺[J].东北林业大学学报，2002，30（4）：19-21.
[8]刘振南.用正交法探讨山楂叶中黄酮类化合物的乙醇提取工艺[J].广西民族学院学报（自然科学报），1999，5（3）：27-28.
[9]李秀信，刘青利，张院民等.香椿叶总黄酮提取方法研究[J].西北林学院院报，2002，17（1）：68-69.
[10]Massaelli H Z,Sobrattee S,Pierce G N,The importance of Lipid solubility in antioxidant and tyee radical generating system for determing lipaprotein peroxidation [J]Free Radical Biology Medicinc.1999,(26):1524-1530.
[11]田金河,曾庆孝,杨程芳.不同显色方法测定绿豆壳中黄酮含量的比较研究[J].粮油加工与食品机械,2003,(11).：64-67.
[12]张延志，候镜德.苦竹叶中黄酮类化合物的液相色谱-质谱联用分析[J].宁波高等专科学校学报，2001，13：89-92.
[13]张延志，候镜德.高效液相色谱法测定苦竹叶中总黄酮[J].宁波高等专科学校学报1996，18（1）：199-200.
[14]陈云龙，谢笔钧，胡慰望.HPLC和UV 测定银杏叶提取物中总黄酮糖苷含量的研究[J].中国药学杂质，1997，32（增）：28-30.
[15] 曾凡骏，陈松波，曾里等.一种改进的银杏黄酮紫外分光光度检测方法的研究[J].食品科学，2003，24（11）：102-104.
作者简介：
刘晓燕：（1965.1—），女，副教授，现任教于绵阳师范学院化学与化学工程学院，主要研究方向：无机化学和环境化学。