【摘 要】
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利用氯霉素乙酰基转移酶(CAT)N端融合了可溶性蛋白细胞所表现出的氯霉素抗性高于不溶性蛋白这一特点,建立了一种能在大肠杆菌中方便地检测到目的蛋白可溶性的报告系统.以pMal
【机 构】
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中国人民解放军第二炮兵总医院呼吸内科,北京,100088中国人民解放军第二炮兵总医院检验科,北京,100088;
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利用氯霉素乙酰基转移酶(CAT)N端融合了可溶性蛋白细胞所表现出的氯霉素抗性高于不溶性蛋白这一特点,建立了一种能在大肠杆菌中方便地检测到目的蛋白可溶性的报告系统.以pMal-p2X高效表达载体为基础,采用PCR法扩增CAT基因,并通过引物向CAT中引入所需的多克隆位点、终止密码子及linker,将扩增得到的CAT片段插入到pMal-p2X中,构建pCAR报道质粒并作测序鉴定;PCR分别扩增IGF1、IL-3、Trx基因,连接到pCAR载体上,导入大肠杆菌原核表达系统中进行诱导表达,SDS-PAGE分析、氯霉素抗性试验对表达目的蛋白的可溶性和表现出的氯霉素抗性的相关性加以验证.结果显示用该载体表达的重组蛋白的可溶性与氯霉素抗性具有很强的相关性.本报告系统能通过直观的平板氯霉素抗性高低正确指示位于CAT N端的目的蛋白的可溶性,为其在生物工程和蛋白质构象相关疾病研究等领域的应用打下了基础.
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