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[摘 要] 微生物食品安全是当前消费者与食品工业共同关注的话题,食品中致病菌的快速、准确、简便检测,对于食品安全质量控制以及食品链中致病性细菌的溯源追踪具有重要作用。在选用微生物的快速检测方法时，应该考虑到方法的预期目标的精确性、检测时间、经济性、可接受性、操作简便性、技术服务等因素。介绍了PCR检测技术的概况,分析了PCR技术的原理及在食品检测中的应用，进一步说明了这种技术在食品微生物检测中的发展和应用。
[关键词] 食品安全 PCR检测技术 分类 应用
前言
食品是人类赖以生存和发展的物质基础，而食品营养、安全问题是关系到人体健康和国计民生的重大问题，特别是近年来发生的一些食源性疾病和食品安全问题，已经引起了人们的高度重视[1]。因此,食品中致病菌的快速、准确、简便检测,对于食品安全质量控制以及食品链中致病性细菌的溯源追踪具有重要作用[2]。
尽管食品微生物的检测方法有很多种,但传统的检测方法费时、操作复杂，因此，针对食品中的致病和致腐微生物的快速检测方法已成为国内外学者的研究热点[3]。聚合酶链反应技术（PCR）方法应用于微生物检验，具有快速、特异性强、灵敏度高等突出优点[4]，因此越来越得到学术界的重视。
1 聚合酶链反应技术(PCR)概况
PCR(PolymeraseChainReaetion)即聚合酶链式反应，一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，也称无细胞克隆系统。该方法可使极微量的目的基因或特定的DNA序列在短短几个小时内扩增至百万倍[5]。PCR技术是1983年由Millus和Cetus利用DNA变性与复性原理，针对目的基因设计一对特异寡核苷酸为引物的DNA小片段和4种脱氧核苷三磷酸dNTP，DNA聚合酶，以目的基因为模板进行的DNA体外精确扩增技术.由于反应进行多次循环，所以在短时间内扩增获得大量目的基因[6].PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进来检验和纯化，进行克隆、转化和测序.此项技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强等特点。在该技术的应用中，大部分研究集中在微生物的生态分布和其他一些真菌上面，也有报道在肉中微生物检测的应用[7]，相信该技术的成熟应用必将为食品学研究带来变革。
2 PCR技术的基本原理[8、9]
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成:
(1)模板DNA的变性 模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
(2)模板DNA与引物的退火(复性) 模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
(3)引物的延伸 DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。这就完成了一个PCR循环，新合成的链都可作为下一次反应的模板，因此扩增产物的量是以指数级方式增加。
3 PCR技术在食品中的应用
从食品基质中直接提取DNA作为模板进行PCR分析，由图谱了解食品中微生物的情况，作为食品的一项特性，与理化、感官特性一样，可以用于分析, 这种方法可作为食品生物特性的鉴定和食品质量控制的有效工具。PCR还可用于检测矿泉水的卫生质量。研究表明地下水和矿泉水具有不同的指纹图谱，且样品中还存在不可培养的微生物。含特定微生物种群的食品，其PCR图谱非常简单，每条带都与预期的菌的条带相对应[10]。如酸奶、含益生菌的饮料或基质, 可以用来鉴定产品中的益生菌含量与标签上所标明的内容是否一致。
3.1 PCR技术在水产品检测中的应用
近几年，我国水产养殖业发展迅速，淡水养殖、海水养殖成为新一轮的投资热点。因此PCR技术在水产养殖动物疾病诊断上的应用，对水产经济动物的健康养殖具有重要的意义。Lin[11]对从马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)和紫石斑鱼(E.laneeolatus)分离的NNV编码衣壳蛋白的RNAZ基因进行了克隆和测序。
3.2 PCR技术在饮用水中致病性微生物的应用
饮用水中的致病性微生物包括病毒、细菌、原生动物、蠕虫等4类.大部分为肠源性，由粪便污染环境，再通过消化道进入新的宿主.由于人类以及动物粪便污染是水中病原体侵入机体的主要途径，所以说污水是威胁健康的主要渠道.各项研究表明，PCR 技术从分子水平上分析微生物的种群特征，能够迅速、准确水样中微生物的分类、鉴定和种群动态分析[6]。
3.3 PCR技术在食源性病原微生物检测中的应用
PCR技术具有敏感、专一等特点,不仅可以对病原微生物进行特异性识别,而且可以鉴别同一种类病原微生物的致病性菌株和非致病性菌株,因此应用PCR技术进行病原微生物的检测具有十分独特的优势[12]。PCR技术在食品微生物中的应用也愈来愈广泛,部分常见食源性病原微生物的PCR检测已有相应的商品试剂盒出售。
3.4 PCR技术在沙门氏菌检测中的应用
沙门氏菌能造成全身感染、食品中毒以及非常重要的动物性传播疾病。近年来，用PCR技术检测沙门氏菌得到了迅速发展。用PCR技术对各种不同血清型的沙门菌和已知被该菌污染的鱼粉和动物产品的肉汤养物进行检测，结果显示该方法特异性高，且灵敏、快速，可检出0.05pg水平的DNA，并可在1天之内完成[13]。
4 结论
PCR在食品微生物中的应用前景很大。当前，用于食品微生物检测的方法耗时、昂贵，而且结果也不是那么准确，但采用分子生物学方法便可快速的得到可靠的结果。PCR可快速监测食品成熟阶段中微生物的情况，评价产品中微生物的群落。总之,PCR技术的应用提高了环境微生物检测技术的局限性及检测速度,克服了传统培养法的种种缺陷,随着PCR技术的进一步发展和完善,其必将会得到更加普遍的推广和发挥更大的效用。
参 考 文 献
[1]杨卫军, 张小军, 张坤朋, 张光杰. PCR技术在食品微生物检测中的应用[J]. 安阳工学院学报, 2008, 4: 16-18.
[2]Bhagwataa. Smiultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes and Salmonella strains by real-tmie PCR[J]. Int J Food Microbio, 2003, 84: 217-224.
[3]徐岩, 张丽萍, 顾国贤. 聚合酶链式反应(PCR)技术鉴定啤酒腐败菌的最新进展[J]. 酿酒科技, 2000, 27(5).
[4]Noble R T, Weisberg S B. A review of technologies for rapid detection of bacteria in recreational waters [J]. Journal of Water and Health, 2005, 3(4): 381-392.
[5]方平. PCR技术在食源性致病微生物快速检测中的应用[J]. 学术论坛, 2006, 11: 14.
[6]金明兰, 尹军. 饮用水中致病性微生物PCR快速检测技术研究进展[J]. 吉林建筑工程学院学报, 2010, 4: 57-60.
[7]徐振, 徐幸莲, 周光宏. PCR-DGGE/TGGE技术在食品微生物分子生态研究中的应用[ J ] . 江西农业学报, 2007, 19(7): 94-96.
[8]彭会清, 余盛颖, 赵欢. PCR技术在环境微生物检测中的应用[J]. 资源环境与工程, 2007, 21, 5: 610-611.
[9]瞿礼嘉. 现代生物技术导论[M].高等教育出版社, 1998.
[10]王俊钢, 李开雄, 卢士玲. PCR-DGGE技术在食品微生物中应用的研究进展[J]. 肉类研究, 2009, 6: 59-62.
[11]Lin C S, Lu M W, Tang L, et al. Charaeterization of virus like partieles assembled in a reeombinant baculovirus system expressing the capsid protein of a fish nodavirus[J]. Virology，2001, 290(l): 50-58.
[12]张阳. PCR技术在食源性病原微生物检测中的应用[J]. 信阳农业高等专科学校学报, 2007, 17(4): 135-137.
[13]沈孝民, 涂书清. 用PCR技术检测动物产品中沙门氏菌的研究[J]. 追究动物检疫, 1997, 14(2): 8-10.
[关键词] 食品安全 PCR检测技术 分类 应用
前言
食品是人类赖以生存和发展的物质基础，而食品营养、安全问题是关系到人体健康和国计民生的重大问题，特别是近年来发生的一些食源性疾病和食品安全问题，已经引起了人们的高度重视[1]。因此,食品中致病菌的快速、准确、简便检测,对于食品安全质量控制以及食品链中致病性细菌的溯源追踪具有重要作用[2]。
尽管食品微生物的检测方法有很多种,但传统的检测方法费时、操作复杂，因此，针对食品中的致病和致腐微生物的快速检测方法已成为国内外学者的研究热点[3]。聚合酶链反应技术（PCR）方法应用于微生物检验，具有快速、特异性强、灵敏度高等突出优点[4]，因此越来越得到学术界的重视。
1 聚合酶链反应技术(PCR)概况
PCR(PolymeraseChainReaetion)即聚合酶链式反应，一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，也称无细胞克隆系统。该方法可使极微量的目的基因或特定的DNA序列在短短几个小时内扩增至百万倍[5]。PCR技术是1983年由Millus和Cetus利用DNA变性与复性原理，针对目的基因设计一对特异寡核苷酸为引物的DNA小片段和4种脱氧核苷三磷酸dNTP，DNA聚合酶，以目的基因为模板进行的DNA体外精确扩增技术.由于反应进行多次循环，所以在短时间内扩增获得大量目的基因[6].PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进来检验和纯化，进行克隆、转化和测序.此项技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强等特点。在该技术的应用中，大部分研究集中在微生物的生态分布和其他一些真菌上面，也有报道在肉中微生物检测的应用[7]，相信该技术的成熟应用必将为食品学研究带来变革。
2 PCR技术的基本原理[8、9]
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成:
(1)模板DNA的变性 模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
(2)模板DNA与引物的退火(复性) 模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
(3)引物的延伸 DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。这就完成了一个PCR循环，新合成的链都可作为下一次反应的模板，因此扩增产物的量是以指数级方式增加。
3 PCR技术在食品中的应用
从食品基质中直接提取DNA作为模板进行PCR分析，由图谱了解食品中微生物的情况，作为食品的一项特性，与理化、感官特性一样，可以用于分析, 这种方法可作为食品生物特性的鉴定和食品质量控制的有效工具。PCR还可用于检测矿泉水的卫生质量。研究表明地下水和矿泉水具有不同的指纹图谱，且样品中还存在不可培养的微生物。含特定微生物种群的食品，其PCR图谱非常简单，每条带都与预期的菌的条带相对应[10]。如酸奶、含益生菌的饮料或基质, 可以用来鉴定产品中的益生菌含量与标签上所标明的内容是否一致。
3.1 PCR技术在水产品检测中的应用
近几年，我国水产养殖业发展迅速，淡水养殖、海水养殖成为新一轮的投资热点。因此PCR技术在水产养殖动物疾病诊断上的应用，对水产经济动物的健康养殖具有重要的意义。Lin[11]对从马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)和紫石斑鱼(E.laneeolatus)分离的NNV编码衣壳蛋白的RNAZ基因进行了克隆和测序。
3.2 PCR技术在饮用水中致病性微生物的应用
饮用水中的致病性微生物包括病毒、细菌、原生动物、蠕虫等4类.大部分为肠源性，由粪便污染环境，再通过消化道进入新的宿主.由于人类以及动物粪便污染是水中病原体侵入机体的主要途径，所以说污水是威胁健康的主要渠道.各项研究表明，PCR 技术从分子水平上分析微生物的种群特征，能够迅速、准确水样中微生物的分类、鉴定和种群动态分析[6]。
3.3 PCR技术在食源性病原微生物检测中的应用
PCR技术具有敏感、专一等特点,不仅可以对病原微生物进行特异性识别,而且可以鉴别同一种类病原微生物的致病性菌株和非致病性菌株,因此应用PCR技术进行病原微生物的检测具有十分独特的优势[12]。PCR技术在食品微生物中的应用也愈来愈广泛,部分常见食源性病原微生物的PCR检测已有相应的商品试剂盒出售。
3.4 PCR技术在沙门氏菌检测中的应用
沙门氏菌能造成全身感染、食品中毒以及非常重要的动物性传播疾病。近年来，用PCR技术检测沙门氏菌得到了迅速发展。用PCR技术对各种不同血清型的沙门菌和已知被该菌污染的鱼粉和动物产品的肉汤养物进行检测，结果显示该方法特异性高，且灵敏、快速，可检出0.05pg水平的DNA，并可在1天之内完成[13]。
4 结论
PCR在食品微生物中的应用前景很大。当前，用于食品微生物检测的方法耗时、昂贵，而且结果也不是那么准确，但采用分子生物学方法便可快速的得到可靠的结果。PCR可快速监测食品成熟阶段中微生物的情况，评价产品中微生物的群落。总之,PCR技术的应用提高了环境微生物检测技术的局限性及检测速度,克服了传统培养法的种种缺陷,随着PCR技术的进一步发展和完善,其必将会得到更加普遍的推广和发挥更大的效用。
参 考 文 献
[1]杨卫军, 张小军, 张坤朋, 张光杰. PCR技术在食品微生物检测中的应用[J]. 安阳工学院学报, 2008, 4: 16-18.
[2]Bhagwataa. Smiultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes and Salmonella strains by real-tmie PCR[J]. Int J Food Microbio, 2003, 84: 217-224.
[3]徐岩, 张丽萍, 顾国贤. 聚合酶链式反应(PCR)技术鉴定啤酒腐败菌的最新进展[J]. 酿酒科技, 2000, 27(5).
[4]Noble R T, Weisberg S B. A review of technologies for rapid detection of bacteria in recreational waters [J]. Journal of Water and Health, 2005, 3(4): 381-392.
[5]方平. PCR技术在食源性致病微生物快速检测中的应用[J]. 学术论坛, 2006, 11: 14.
[6]金明兰, 尹军. 饮用水中致病性微生物PCR快速检测技术研究进展[J]. 吉林建筑工程学院学报, 2010, 4: 57-60.
[7]徐振, 徐幸莲, 周光宏. PCR-DGGE/TGGE技术在食品微生物分子生态研究中的应用[ J ] . 江西农业学报, 2007, 19(7): 94-96.
[8]彭会清, 余盛颖, 赵欢. PCR技术在环境微生物检测中的应用[J]. 资源环境与工程, 2007, 21, 5: 610-611.
[9]瞿礼嘉. 现代生物技术导论[M].高等教育出版社, 1998.
[10]王俊钢, 李开雄, 卢士玲. PCR-DGGE技术在食品微生物中应用的研究进展[J]. 肉类研究, 2009, 6: 59-62.
[11]Lin C S, Lu M W, Tang L, et al. Charaeterization of virus like partieles assembled in a reeombinant baculovirus system expressing the capsid protein of a fish nodavirus[J]. Virology，2001, 290(l): 50-58.
[12]张阳. PCR技术在食源性病原微生物检测中的应用[J]. 信阳农业高等专科学校学报, 2007, 17(4): 135-137.
[13]沈孝民, 涂书清. 用PCR技术检测动物产品中沙门氏菌的研究[J]. 追究动物检疫, 1997, 14(2): 8-10.