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摘要[目的]研究化学诱变枯草芽孢杆菌对大白菜根肿病的防治效果。[方法]采用3株来自枯草芽孢杆菌XF1的化学诱变菌株XF1A、XF1C和XF1E进行大白菜根肿病的盆栽防病试验，并以MALDITOFMS分析了3种抗生素的相对含量。[结果]菌株XF1A和XF1C防效较好，分别为68.80%和65.06%，XF1E防效较差为42.21%。3菌株均能分泌表面活性素、伊枯草菌素和丰源素，但表面活性素和伊枯草菌素相对含量为XF1A>XF1C>XF1E，XF1A的表面活性素和伊枯草菌素分别达29.26%和35.31%，XF1E的丰源素含量最高，达41.09%。[结论]表面活性素和伊枯草菌素含量与对根肿病防治效果存在一定的关联性
关键词根肿病；表面活性素；伊枯草菌素；丰源素
中图分类号S432.4+2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02597-03
基金项目农业部公益性行业（农业）科研专项（201003029）；云南省支撑计划项目（2009EB060）。
作者简介杨晶晶（1985- ），男，云南曲靖人，硕士研究生，研究方向：植物病害可持续管理。*通讯作者，教授，博士生导师，从事病害可持续控制方面的研究。
十字花科根肿病是由芸苔根肿菌侵染引起的病害[1]。该菌主要侵染十字花科植物根部，在根部组织中产生细胞分裂素和吲哚乙酸等物质，引起根部薄壁细胞大量分裂和增生，从而形成肿瘤，植株地上部出现矮化、失水、萎蔫直至死亡，根部出现根瘤状物[2-6]。某些枯草芽孢杆菌能产生多种抗菌活性物质，以伊枯草菌素（Iturin）、表面活性素（surfactin）、丰源素（fengycin）三大家族为主[7]。伊枯草素能够影响细胞膜的表面张力，增加生物分子脂质膜的导电性[8]，导致微孔的形成、K+及其他重要离子的渗漏，最后引起细胞死亡[9]，具有较强的抗真菌活性[10]，也有部分抑制细菌的作用[11]；表面活性素具有抗病毒、抗肿瘤、抗支原体和抗细菌活性[12]；丰源素能抑制真菌生长，尤其对丝状真菌抑制活性最强[13]。
由于根肿病防治较难，目前田间防治主要采用化学农药，但因化学农药对土壤环境有负面影响，且不宜长期使用。为寻找有效、更安全的防治方法，笔者开展了3株化学诱变的枯草芽孢杆菌盆栽防病试验，同时测定其抗生素类含量。
1材料与方法
1.1菌株来自防治根肿病效果较好的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XF1化学诱变菌株XF1A、XF1C、XF1E和云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程中心保存的三七根腐病菌（Fusarium soloni）以及田间采回的活体根肿病菌。
1.2试剂与材料乙腈（ACN）（色谱纯），三氟醋酸（TFA）（色谱纯），α氰基4羟基肉桂酸（CHCA）（色谱纯），重蒸水，白菜种子（青岛831），花盆（上口直径15.0 cm，下口直径10.5 cm，高12.5 cm）。
质谱仪：Bruker Autoflex Speed MALDITOFMS（Bruker Daltonics，Billerica，MA，USA）。
提取溶剂：70 ml乙腈，0.1 ml TFA，用重蒸水定容至100 ml。
辅助基质溶液配制：常温下用提取溶剂溶解CHCA配成饱和溶液。
1.3枯草芽孢杆菌抑菌试验 （1）挑取三七根腐菌丝块接于PD培养基，培养72 h（28 ℃，140 r/min），将培养菌液稀释100倍，取100 μl稀释的菌液涂布于PDA平板上，再接种单菌落的芽孢杆菌，置于28 ℃恒温培养箱内培养3 d，观察抑菌结果。
（2）将试验菌株单菌落接种于4瓶250 ml LB液体培养基中，振荡培养72 h（37 ℃，150 r/min），25 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液1 000 ml，加入硫酸铵至80%饱和度，4 ℃沉淀24 h，收集沉淀冷冻干燥，称取冷冻干燥的提取物0.1 g加入900 μl无菌水溶解。将培养72 h的三七根腐菌稀释100倍，取100 μl涂布于PDA 培养基上，用直径6 mm打孔器打孔，在孔中加入提取物的水溶液20 μl，置28 ℃恒温培养箱培养3 d。
1.4盆栽试验
1.4.1白菜种植。采集不含根肿孢子的耕作层土壤，加入草炭和珍珠岩混拌均匀（土壤∶草炭∶珍珠岩= 2∶1∶1），称取1 000 g置入直径15 cm的花盆中，同时称取3 g新鲜根肿组织，加50 ml无菌水，以水果榨汁匀浆机打碎，加入无菌水至体积为100 ml混匀，浇灌于上述准备的土壤表面，待花盆表面土层水分渗透后，疏松土壤表面，并均匀播种25粒感病大白菜品种“青岛831”种子，覆土约1 cm。
1.4.2处理设计与栽培管理。设4个处理，分别为XF1A、XF1C、XF1E和空白对照（CK），每个处理3个重复。各试验菌株分别于250 ml LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养72 h，然后分别稀释5倍（约107个/ml），取100 ml均匀浇入盆中，CK以LB培养液稀释5倍浇入。每隔4 d浇菌液1次，共浇5次。在第5和10天间苗，最终每盆中保留14苗。
1.4.3病情调查。35 d采收大白菜，将所有的白菜拔起，用水清洗根部泥土，根据分级标准[14]调查根肿病的发生情况。
盆栽苗期病情分级标准：0级：根部无肿瘤；1级：仅侧根肿大，侧根有小肿瘤；3级：主根肿大，其直径小于2倍茎基部；5级：主根肿大，其直径是茎基部的2～3倍；7级：主根肿大，其直径是茎基部的3～4倍；9级：主根肿大，其直径是茎基部的4倍以上，或肿瘤龟裂。
病情指数=（各级病株数×相应病级数）调查总数×9×100 防治效果（%）=对照病情指数-处理病情指数对照病情指数×100
1.5MALDITOFMS检测挑取各生防菌20个单菌落分别装于2 ml离心管中，各加入1 ml提取溶剂，振荡2 min后在12 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min，取上清液分别装于1.5 ml离心管中保存于4 ℃冰箱中。取2 μl细胞表面提取液于目标板孔靶上，加等体积的辅助基质混匀，自然风干后进行MALDITOFMS检测。仪器参数为反谢操作模式；正离子检测；检测范围100～2 000 Da；激光点击数每图谱50；激光频率30.0 Hz；离子源加速电压20 kV；反谢电压23.5 kV脉冲离子。
2结果与分析
2.13个菌株的抑菌活性菌株和其代谢产物对三七根腐病菌的抑菌结果见图1。由图1可知，枯草芽孢杆菌XF1A、XF1C和XF1E对三七根腐病菌有较强的拮抗作用，培养3 d后形成透明的抑菌圈，抑菌圈大小为1.2～1.4 cm，3个菌株的抑菌作用较菌株XF-1增强；发酵菌株的上清液对三七根腐病菌的拮抗作用优于野生菌株XF1。注：1为接菌株，2、3、4分别为菌株提取液。
2.3MALDITOFMS检测枯草芽孢杆菌的次生代谢物3株枯草芽孢杆菌细胞表面提取物经MALDITOFMS检测，证明它们均能分泌表面活性素、伊枯草菌素和丰源素，且这3类环脂肽化合物为3菌株细胞表面提取物的主要成分。但3类物质在各菌株中的相对含量不同（图3），其中表面活性素和伊枯草菌素相对含量为XF1A>XF1C>XF1E，XF1A的表面活性素和伊枯草菌素最高，分别为29.26%和35.31%，XF1E的丰源素最高，高达41.09%。
3讨论
由于根肿病菌不能在人工培养基中培养，该研究采用三七根腐病菌为指示菌。在3株化学诱变的枯草芽孢杆菌拮图2枯草芽孢杆菌处理后大白菜根肿病症状图33个菌株环肽抗生素含量抗真菌的试验中，发现菌株及其发酵液提取物对三七根腐病菌均具有拮抗作用，且较野生型菌株XF-1有明显提高。大白菜根肿病的盆栽防治试验结果显示，枯草芽孢杆菌XF1A和XF1C对根肿病的防治效果较好，XF1E的防治效果较差。分析防病效果与三七根腐病菌（F.solani）的拮抗作用，两者之间没有直接的联系，即拮抗能力强的菌株不一定对根肿病有较好的防效。这可能与三七根腐病菌同十字花科作物根肿病菌形态结构等存在差异有关。因此，尽管三七根腐病菌具有生长快、产孢量大、同根肿病菌细胞壁由几丁质组成等优点，但在筛选防治根肿病的生防菌株时，在得到大量具抑菌作用的生防菌株后，应以根肿病菌作为靶标进行复筛，以提高筛选优良生防菌株的工作效率和降低成本。MALDITOFMS检测发现代谢产物有较大的变化，菌株XF1A和XF-1C代谢物中表面活性素和伊枯草菌素的相对含量较高，防病效果较好，而菌株XF1E代谢物中表面活性素和伊枯草菌素的相对含量较低，防病效果差。
3突变菌株代谢物伊枯草菌素、表面活性素和丰源素相对含量变化差异明显，但有一共同的趋势：伊枯草菌素和表面活性素相对含量较高时，丰源素的相对含量较低（突变菌株XF1A和XF1C）；丰源素相对含量较高时，伊枯草菌素和表面活性素相对含量较低（突变菌株XF1E）。董伟欣等[15]研究NCD2菌株发现，脂肽提取物中主要为丰源素，缺失fenC基因的突变子丧失了丰源素的合成能力，但突变子中产生了一种与杆菌霉素D（bacillomycin D）具有一致分子量的新物质。李兴玉[16]检测解淀粉芽孢杆菌B9601Y2代谢产物，发现其丰源素相对含量高达68.75%，但没有检测到表面活性素，检测到少量的伊枯草菌素，该菌株对多种真菌具有较强拮抗作用。在野生XF1菌株中丰源素相对含量较高，伊枯草菌素和表面活性素相对含量较低，其中伊枯草菌素的相对含量远低于丰源素[16]。比较分析的结果表明，枯草芽孢杆菌的代谢产物中丰源素类物质的合成影响伊枯草菌素的合成，两者呈负相关，即当菌株丰源素产物的相对含量提高时，伊枯草菌素产物的相对含量降低。
参考文献
[1] 孙保亚，沈向群，郭海峰，等.十字花科植物根肿病及抗病育种研究进展[J].中国蔬菜，2005（4）：34-37.
[2] 张琴.根肿病防治药剂的筛选和防治研究[D].雅安：四川农业大学，2012.
[3] 周俊.十字花科作物根肿病发生规律及防治[J].植物医生，2011，24（6）：42-43.
[4] 钟源.十字花科根肿病的发生规律油菜抗性鉴定及生物防治研究[D].雅安：四川农业大学，2008.
[5] 司军，李成琼，任雪松，等.十字花科植物根肿病及抗根肿病育种研究进展[J].西南农业学报，2002（15）：69-72.
[6] 苏珍琴.十字花科蔬菜根肿病的防治技术[J].西昌农业科技，2010（1）：22-23.
[7] KIM P，BAI H，BAI D，et al.Purification and characterization of a lipopeptide produced by Bacillus thuringiensis CMB26[J].Journal of Applied Microbiology，2004，97：942-949.
[8] TANAKA Y，TOJO T，UCHIDA K，et al.Method of producing iturin A and antifungal agent for profound mycosis[J].Biotechnology Advances，1997，15：234-235.
[9] 李德全，陈志谊，聂亚锋.生防菌Bs-916及高效突变菌株抗菌物质及其对水稻抗性诱导作用的研究[J].植物病理学报，2008，38（2）：192-198.
[10] STEIN T.Bacillus subtilis antibiotics：structures，syntheses and specific functions[J].Molecular Microbiology，2005，56（4）：845-857.
[11] 黄现青.Bacillus subtilis fmbJ 产生的脂肽抗微生物效果及安全性评价[D].南京：南京农业大学，2006.
[12] KRACHT M，ROKOS H，OZEL M，et al.Antiviral and hemolytic activities of surfactin isoforms and their methyl ester derivatives[J].The Journal of Antibiotics，1999，52：613-619.
[13] DELEU M，PAQUOT M，NYLANDER T.Effect of Fengycin，a Lipopeptide Produced by Bacillus subtilis，on Model Biomembranes[J].Biophysical Journal，2008，94（7）：2667-2679.
[14] 吴道军，陈国康，杨晓琴，等.4种甘蓝根肿病分级标准的应用评价[J].西南农业学报，2013，26（2）：591-594.
[15] 董伟欣，李宝庆，李社增，等.脂肽类抗生素fengycin 在枯草芽胞杆菌 NCD-2 菌株抑制番茄灰霉病菌中的功能分析[J].植物病理学报，2013，43（4）：401-410.
关键词根肿病；表面活性素；伊枯草菌素；丰源素
中图分类号S432.4+2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02597-03
基金项目农业部公益性行业（农业）科研专项（201003029）；云南省支撑计划项目（2009EB060）。
作者简介杨晶晶（1985- ），男，云南曲靖人，硕士研究生，研究方向：植物病害可持续管理。*通讯作者，教授，博士生导师，从事病害可持续控制方面的研究。
十字花科根肿病是由芸苔根肿菌侵染引起的病害[1]。该菌主要侵染十字花科植物根部，在根部组织中产生细胞分裂素和吲哚乙酸等物质，引起根部薄壁细胞大量分裂和增生，从而形成肿瘤，植株地上部出现矮化、失水、萎蔫直至死亡，根部出现根瘤状物[2-6]。某些枯草芽孢杆菌能产生多种抗菌活性物质，以伊枯草菌素（Iturin）、表面活性素（surfactin）、丰源素（fengycin）三大家族为主[7]。伊枯草素能够影响细胞膜的表面张力，增加生物分子脂质膜的导电性[8]，导致微孔的形成、K+及其他重要离子的渗漏，最后引起细胞死亡[9]，具有较强的抗真菌活性[10]，也有部分抑制细菌的作用[11]；表面活性素具有抗病毒、抗肿瘤、抗支原体和抗细菌活性[12]；丰源素能抑制真菌生长，尤其对丝状真菌抑制活性最强[13]。
由于根肿病防治较难，目前田间防治主要采用化学农药，但因化学农药对土壤环境有负面影响，且不宜长期使用。为寻找有效、更安全的防治方法，笔者开展了3株化学诱变的枯草芽孢杆菌盆栽防病试验，同时测定其抗生素类含量。
1材料与方法
1.1菌株来自防治根肿病效果较好的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XF1化学诱变菌株XF1A、XF1C、XF1E和云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程中心保存的三七根腐病菌（Fusarium soloni）以及田间采回的活体根肿病菌。
1.2试剂与材料乙腈（ACN）（色谱纯），三氟醋酸（TFA）（色谱纯），α氰基4羟基肉桂酸（CHCA）（色谱纯），重蒸水，白菜种子（青岛831），花盆（上口直径15.0 cm，下口直径10.5 cm，高12.5 cm）。
质谱仪：Bruker Autoflex Speed MALDITOFMS（Bruker Daltonics，Billerica，MA，USA）。
提取溶剂：70 ml乙腈，0.1 ml TFA，用重蒸水定容至100 ml。
辅助基质溶液配制：常温下用提取溶剂溶解CHCA配成饱和溶液。
1.3枯草芽孢杆菌抑菌试验 （1）挑取三七根腐菌丝块接于PD培养基，培养72 h（28 ℃，140 r/min），将培养菌液稀释100倍，取100 μl稀释的菌液涂布于PDA平板上，再接种单菌落的芽孢杆菌，置于28 ℃恒温培养箱内培养3 d，观察抑菌结果。
（2）将试验菌株单菌落接种于4瓶250 ml LB液体培养基中，振荡培养72 h（37 ℃，150 r/min），25 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液1 000 ml，加入硫酸铵至80%饱和度，4 ℃沉淀24 h，收集沉淀冷冻干燥，称取冷冻干燥的提取物0.1 g加入900 μl无菌水溶解。将培养72 h的三七根腐菌稀释100倍，取100 μl涂布于PDA 培养基上，用直径6 mm打孔器打孔，在孔中加入提取物的水溶液20 μl，置28 ℃恒温培养箱培养3 d。
1.4盆栽试验
1.4.1白菜种植。采集不含根肿孢子的耕作层土壤，加入草炭和珍珠岩混拌均匀（土壤∶草炭∶珍珠岩= 2∶1∶1），称取1 000 g置入直径15 cm的花盆中，同时称取3 g新鲜根肿组织，加50 ml无菌水，以水果榨汁匀浆机打碎，加入无菌水至体积为100 ml混匀，浇灌于上述准备的土壤表面，待花盆表面土层水分渗透后，疏松土壤表面，并均匀播种25粒感病大白菜品种“青岛831”种子，覆土约1 cm。
1.4.2处理设计与栽培管理。设4个处理，分别为XF1A、XF1C、XF1E和空白对照（CK），每个处理3个重复。各试验菌株分别于250 ml LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养72 h，然后分别稀释5倍（约107个/ml），取100 ml均匀浇入盆中，CK以LB培养液稀释5倍浇入。每隔4 d浇菌液1次，共浇5次。在第5和10天间苗，最终每盆中保留14苗。
1.4.3病情调查。35 d采收大白菜，将所有的白菜拔起，用水清洗根部泥土，根据分级标准[14]调查根肿病的发生情况。
盆栽苗期病情分级标准：0级：根部无肿瘤；1级：仅侧根肿大，侧根有小肿瘤；3级：主根肿大，其直径小于2倍茎基部；5级：主根肿大，其直径是茎基部的2～3倍；7级：主根肿大，其直径是茎基部的3～4倍；9级：主根肿大，其直径是茎基部的4倍以上，或肿瘤龟裂。
病情指数=（各级病株数×相应病级数）调查总数×9×100 防治效果（%）=对照病情指数-处理病情指数对照病情指数×100
1.5MALDITOFMS检测挑取各生防菌20个单菌落分别装于2 ml离心管中，各加入1 ml提取溶剂，振荡2 min后在12 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min，取上清液分别装于1.5 ml离心管中保存于4 ℃冰箱中。取2 μl细胞表面提取液于目标板孔靶上，加等体积的辅助基质混匀，自然风干后进行MALDITOFMS检测。仪器参数为反谢操作模式；正离子检测；检测范围100～2 000 Da；激光点击数每图谱50；激光频率30.0 Hz；离子源加速电压20 kV；反谢电压23.5 kV脉冲离子。
2结果与分析
2.13个菌株的抑菌活性菌株和其代谢产物对三七根腐病菌的抑菌结果见图1。由图1可知，枯草芽孢杆菌XF1A、XF1C和XF1E对三七根腐病菌有较强的拮抗作用，培养3 d后形成透明的抑菌圈，抑菌圈大小为1.2～1.4 cm，3个菌株的抑菌作用较菌株XF-1增强；发酵菌株的上清液对三七根腐病菌的拮抗作用优于野生菌株XF1。注：1为接菌株，2、3、4分别为菌株提取液。
2.3MALDITOFMS检测枯草芽孢杆菌的次生代谢物3株枯草芽孢杆菌细胞表面提取物经MALDITOFMS检测，证明它们均能分泌表面活性素、伊枯草菌素和丰源素，且这3类环脂肽化合物为3菌株细胞表面提取物的主要成分。但3类物质在各菌株中的相对含量不同（图3），其中表面活性素和伊枯草菌素相对含量为XF1A>XF1C>XF1E，XF1A的表面活性素和伊枯草菌素最高，分别为29.26%和35.31%，XF1E的丰源素最高，高达41.09%。
3讨论
由于根肿病菌不能在人工培养基中培养，该研究采用三七根腐病菌为指示菌。在3株化学诱变的枯草芽孢杆菌拮图2枯草芽孢杆菌处理后大白菜根肿病症状图33个菌株环肽抗生素含量抗真菌的试验中，发现菌株及其发酵液提取物对三七根腐病菌均具有拮抗作用，且较野生型菌株XF-1有明显提高。大白菜根肿病的盆栽防治试验结果显示，枯草芽孢杆菌XF1A和XF1C对根肿病的防治效果较好，XF1E的防治效果较差。分析防病效果与三七根腐病菌（F.solani）的拮抗作用，两者之间没有直接的联系，即拮抗能力强的菌株不一定对根肿病有较好的防效。这可能与三七根腐病菌同十字花科作物根肿病菌形态结构等存在差异有关。因此，尽管三七根腐病菌具有生长快、产孢量大、同根肿病菌细胞壁由几丁质组成等优点，但在筛选防治根肿病的生防菌株时，在得到大量具抑菌作用的生防菌株后，应以根肿病菌作为靶标进行复筛，以提高筛选优良生防菌株的工作效率和降低成本。MALDITOFMS检测发现代谢产物有较大的变化，菌株XF1A和XF-1C代谢物中表面活性素和伊枯草菌素的相对含量较高，防病效果较好，而菌株XF1E代谢物中表面活性素和伊枯草菌素的相对含量较低，防病效果差。
3突变菌株代谢物伊枯草菌素、表面活性素和丰源素相对含量变化差异明显，但有一共同的趋势：伊枯草菌素和表面活性素相对含量较高时，丰源素的相对含量较低（突变菌株XF1A和XF1C）；丰源素相对含量较高时，伊枯草菌素和表面活性素相对含量较低（突变菌株XF1E）。董伟欣等[15]研究NCD2菌株发现，脂肽提取物中主要为丰源素，缺失fenC基因的突变子丧失了丰源素的合成能力，但突变子中产生了一种与杆菌霉素D（bacillomycin D）具有一致分子量的新物质。李兴玉[16]检测解淀粉芽孢杆菌B9601Y2代谢产物，发现其丰源素相对含量高达68.75%，但没有检测到表面活性素，检测到少量的伊枯草菌素，该菌株对多种真菌具有较强拮抗作用。在野生XF1菌株中丰源素相对含量较高，伊枯草菌素和表面活性素相对含量较低，其中伊枯草菌素的相对含量远低于丰源素[16]。比较分析的结果表明，枯草芽孢杆菌的代谢产物中丰源素类物质的合成影响伊枯草菌素的合成，两者呈负相关，即当菌株丰源素产物的相对含量提高时，伊枯草菌素产物的相对含量降低。
参考文献
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[12] KRACHT M，ROKOS H，OZEL M，et al.Antiviral and hemolytic activities of surfactin isoforms and their methyl ester derivatives[J].The Journal of Antibiotics，1999，52：613-619.
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[14] 吴道军，陈国康，杨晓琴，等.4种甘蓝根肿病分级标准的应用评价[J].西南农业学报，2013，26（2）：591-594.
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