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[摘要]目的：研究丹参纳米银复合材料(salvia M．1tiorrhiza/Naflo-silver composite)的生物安全性。方法：通过无菌试验、热原试验、皮肤刺激试验、皮内刺激试验、全身急性毒性试验及SD大鼠对该材料中银的吸收、代谢情况对自制的丹参纳米银复合材料进行生物安全性评价。结果：丹参纳米银复合材料无菌、无热原、无刺激、无明显急性毒性，且机体对纳米银的吸收比对经典创面抗感染药磺胺嘧啶银少。结论：丹参纳米银复合材料作为创面修复材料具有良好的生物安全性。
[关键词]丹参；纳米银；磺胺嘧啶银；无菌；热原；刺激作用；全身急性毒性
[中图分类号]R644 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)05－0596－04
在金属纳米材料中，银以其独特的抗菌性能而在医学界得到广泛应用，特别是在大量抗生素耐药的今天。而纳米银使银的杀菌能力产生了质的飞跃。因此，在烧伤整形领域出现越来越多的含纳米银的新敷料。一种新的医用生物材料应用于临床前需对其进行安全性评价。因此，本研究对自制的丹参纳米银复合材料进行了无菌试验、热原试验、原发性皮肤刺激试验、皮内刺激试验、急性全身毒性试验及测定全血及组织中的痕量银以评价该材料的生物安全性，为其作为创面修复和种子细胞的支架材料提供理论依据。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂：HS－1300超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；101AB－Z电热恒温热鼓风干燥箱(上海华联环境试验设备公司恒昌仪器厂)；XW－80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；银元素空心阴极灯；360MC型原子吸收分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
丹参注射液(江苏安格药业有限公司，生产批号：061205D)；粉状壳聚糖(浙江玉环化工厂，脱乙酰度90％以上)；冰醋酸(99.5％)，硝酸银，氢氧化钠，柠檬酸三钠等均为分析纯；8％硫化钠溶液，3％戊巴比妥钠。
1.2 实验动物：1.9～2.8kg家兔，17～23g健康小白鼠，0.2kg左右SD大鼠，由南通大学实验动物中心提供。
1.3 实验方法
1.3.1 丹参纳米银复合材料的制备
1.3.1.1 纳米银的制备：根据Meisel报道的方法制备纳米银。
1.3.1.2 壳聚糖膜的制备：用1％冰醋酸溶液溶解壳聚糖得到1.5％的壳聚糖溶液。过滤后倒入塑料培养皿中烘干成膜。
1.3.1.3 丹参纳米银复合材料的制备：通过自组装技术得到丹参纳米银复合材料。
1.3.2 无菌试验：根据中华人民共和国药典(二部，2005)附录XIH进行无菌试验。
1.3.3热原试验
1.3.3.1 浸提液的制备：将丹参纳米银复合材料切成30mm×5mm条状，置于去热原的25ml锥形瓶中，按受试材料3cm2：1ml氯化钠注射液的比例，取一定量的氯化钠注射液于锥形瓶中，置于37℃电热恒温培养箱中浸提72h。72h后将浸提液转移至另一去热原的锥形瓶中，调节pH值为7.0左右，4℃保存备用。以上过程均在洁净工作台上按无菌操作要求进行。
1.3.3.2 热原检查法：根据GB/T16175-1996热原试验，在试验前7天选3只家兔，雌雄不限，雌兔无孕，且测温前7天内应在同一环境条件用同一饲料饲养，在此期间家兔体重无减轻，精神、食欲、排泄等无异常。预测体温时用肛温计插入家兔肛门，深度约6cm，时间为2min，取出肛温计并记下读数。每隔lh测量1次，共测4次，体温均在38.O～39.6℃的范围内，且最高最低体温的差数不超过0.4℃，符合热原试验要求。
3天后将家兔固定于固定器内。30min后开始第1次测量，以后每隔30min测1次，共测2次。体温之差不超过0.2℃，以此2次体温的平均值为该兔的正常体温。且当日使用家兔的体温在38.0～39.6℃的范围内，各兔间正常体温之差不超过1℃。在家兔正常体温符合要求后15min内，自耳静脉缓慢注入预热38℃丹参纳米银复合材料浸提液，剂量为l0ml/kg。注射后每隔1h测量体温1次，6次体温中最高的1次减去正常体温为试验家兔体温升高值。
1.3.4 原发性皮肤刺激试验：受试家兔6只，实验前24h，脊柱两侧各选2个3cm×3cm面积的去毛区，用8％的硫化钠溶液去毛，间距l0cm。用75％(v/V)乙醇消毒背部去毛区，用2.5cm×2.5cm滤纸块浸泡于丹参纳米银复合材料的浸提液中至饱和，贴敷于试验部位。浸提介质生理盐水作为阴性对照，3.5％甲醛溶液作为阳性对照。材料贴敷于皮肤后，立即用3cm×3cm纱布块覆盖，最外层用胶布固定。贴敷固定24h后，移去贴敷物，用温水清洁贴敷区l并吸干，观察移去斑贴物后24、48和72h皮肤的红斑及水肿情况。计算原发刺激指数(PII)，参考文献标准进行记分并评价。
1.3.5 皮内刺激试验：实验前24h，受试家兔脊柱两侧各剪剃5cm×25cm区域兔毛，应避免损伤皮肤。用75％(V/V)乙醇消毒暴露的皮肤。在兔脊柱两侧各选择10个点，每点间隔2cm，每点皮内注射剂量0.2ml。一侧前5点注射丹参纳米银复合材料生理盐水浸提液，后5点注射同批阴性对照生理盐水；另一侧前后5点分别注射丹参纳米银复合材料植物油浸提液和阴性对照植物油。注射后24、48、72h观察注射局部及周围皮肤组织反应，参考文献标准进行记分并评价。
1.3.6 急性全身毒性试验：将健康小白鼠随机分为试验材料组和对照两组，每组5只。试验组动物由尾静脉注射丹参纳米银复合材料生理盐水浸提液，剂量为50ml/kg。对照组动物由尾静脉注射同批号的生理盐水，剂量为50ml/kg。注射后于24、48、72h观察记录试验和对照组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数。观察指标参考文献标准。
1.3.7 银含量测定；0.2kg左右健康成年SD大鼠48只，随机分为正常对照组(12只)，治疗I组(创面外敷丹参纳米银复合材料，12只)、治疗II组(创面外敷纳米银仿生敷料，12只)、治疗III组(创面外敷磺胺嘧啶银粉剂，12只)。治疗I组、II组、III组sD大鼠用取皮刀造成10％～13％TBSA(Tota]Body Surface Area)深II度切割伤。
治疗I组、治疗II组和治疗III组在治疗前和治疗后2天、4天、5天、7天、13天和16天眼眶采血，采用火焰原子吸收分光光度法测定sD大鼠血液中银的含量。当创面恢复半个月后处死SD大鼠，取其肝、脑、肾，用火焰原子吸收分光光度法测定各组织中的银含量。
1.3.8 统计学处理：银含量检测数据，用State 7.0统计软件进行分析。
2 结果
2.1 无菌试验结果：培养5天后，接种有丹参纳米银复合材料的需氧一厌氧菌培养管、环境监测的阴性对照管无菌生长，阳性对照管有菌生长；培养7天后，接种有丹参纳米银复合材料的真菌培养管、环境监测的阴性对照管无菌生长，阳性对照管有菌生长，说明该材料无菌。
2.2 热原试验结果：由表l可见，3只家兔体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.4℃，说明该材料无热原。
2.3 原发性皮肤刺激试验结果：由表2可见，丹参纳米银复合材料浸提液贴敷家兔皮肤未见红斑，无水肿形成，说明该材料对家兔皮肤无刺激性。
2.4 皮内刺激试验结果：表3为皮内刺激试验的结果，可见丹参纳米银复合材料无皮内刺激反应。
2.5 急性全身毒性试验结果：急性全身毒性试验结果见表4。
2.6 全血中银含量的变化：从表5中可以看到丹参纳米银组、纳米银仿生敷料组各个时点血银的含量明显比磺胺嘧啶银组低，丹参纳米银组、纳米银仿生敷料组全血银含量无差异(P＞O.05)。丹参纳米银组、纳米银仿生敷料组银含量最高是正常水平的7倍，而磺胺嘧啶银组高达26倍。第13天，丹参纳米银组、纳米银仿生敷料组SD大鼠血银含量基本恢复正常水平(与正常组银含量0.07±0.03/zg/g相比，P＞0.05)，而此时磺胺嘧啶银组SD大鼠银含量是正常全血银的5倍(P＜0.01)。
2.7 各组织中的银含量：正常sD大鼠肝、脑、肾及血中银含量无统计学意义(p＞0.05)。对深II度切割伤大鼠使用丹参纳米银复合材料、纳米银仿生敷料和磺胺嘧啶银后，各组织银含量都有不同程度的升高，其中肝银含量升高最多，其次为肾，说明肝脏对银的吸收最多，因此如过量吸收会首先造成对肝脏的损害。另外，磺胺嘧啶银组中各组织的银含量明显高于丹参纳米银组、纳米银仿生敷料组，其中磺胺嘧啶组肝脏中银含量是正常的近100倍(P＜0.01)，有统计学意义。
3 讨论
纳米产品在医学生物学领域已经得到广泛的应用，应用前景十分广阔。本文对自制的丹参纳米银仿生敖料进行了初步的安全性评价，主要有无菌、热原及银在体内的分布、蓄积情。试验证实丹参纳米银复合材料无菌、无热原、无皮肤刺激、无皮内刺激作用。同时因银如过量吸收会造成机体的损害，我们用火焰原子吸收分光光度法对SD大鼠血液及肝、脑、肾等各器官的银含量进行测定，发现用该复合材料的治疗组大鼠比磺胺嘧啶银组大鼠对银的吸收少。其原因为：银发挥生物活性，必须以溶液形式存在，如：Ag+或Ag+Ag+通常存在于硝酸银、磺胺嘧啶银和其它银离子化合物中。Ag°是存在于金属或晶体(包括纳米晶体)中，不带电荷的存在形式。在溶液中，它以亚晶体形式存在，小于8个原子的大小。硝酸银、磺胺嘧啶银在浓度大于3200ppm时释放银离子，但是大部分都因形成化学复合物而快速失活。而纳米银提供Ag°形式的银，与离子形式相比较，这种形式的银大部分不与卤化物结合，在有机物质中灭活的速度大大降低，有效的银相对更多。因此，在达到同样的治疗效果时，机体对纳米银的吸收更少，减小了银中毒的可能性，提高了使用的安全性。
编辑 张惠娟
基金项目：江苏省科学技术厅社会发展项目(BS2005030)，江苏省人事厅“六大人才高峰”资助项目，江苏省“青蓝工程”学术带头人项目，江苏省教育厅高新技术项目(JH03－041)及自然科学项目(03KJBl50107，s30016)
通讯作者l：潘立群，教授，主任医师，博士研究生导师：E－mail：dexuansir@hotmail.com
通讯作者2：顾海鹰，教授，博士研究生导师；E－mail：hyguOntu.edu.cn：guhy99@21cn.com
[关键词]丹参；纳米银；磺胺嘧啶银；无菌；热原；刺激作用；全身急性毒性
[中图分类号]R644 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)05－0596－04
在金属纳米材料中，银以其独特的抗菌性能而在医学界得到广泛应用，特别是在大量抗生素耐药的今天。而纳米银使银的杀菌能力产生了质的飞跃。因此，在烧伤整形领域出现越来越多的含纳米银的新敷料。一种新的医用生物材料应用于临床前需对其进行安全性评价。因此，本研究对自制的丹参纳米银复合材料进行了无菌试验、热原试验、原发性皮肤刺激试验、皮内刺激试验、急性全身毒性试验及测定全血及组织中的痕量银以评价该材料的生物安全性，为其作为创面修复和种子细胞的支架材料提供理论依据。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂：HS－1300超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；101AB－Z电热恒温热鼓风干燥箱(上海华联环境试验设备公司恒昌仪器厂)；XW－80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；银元素空心阴极灯；360MC型原子吸收分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
丹参注射液(江苏安格药业有限公司，生产批号：061205D)；粉状壳聚糖(浙江玉环化工厂，脱乙酰度90％以上)；冰醋酸(99.5％)，硝酸银，氢氧化钠，柠檬酸三钠等均为分析纯；8％硫化钠溶液，3％戊巴比妥钠。
1.2 实验动物：1.9～2.8kg家兔，17～23g健康小白鼠，0.2kg左右SD大鼠，由南通大学实验动物中心提供。
1.3 实验方法
1.3.1 丹参纳米银复合材料的制备
1.3.1.1 纳米银的制备：根据Meisel报道的方法制备纳米银。
1.3.1.2 壳聚糖膜的制备：用1％冰醋酸溶液溶解壳聚糖得到1.5％的壳聚糖溶液。过滤后倒入塑料培养皿中烘干成膜。
1.3.1.3 丹参纳米银复合材料的制备：通过自组装技术得到丹参纳米银复合材料。
1.3.2 无菌试验：根据中华人民共和国药典(二部，2005)附录XIH进行无菌试验。
1.3.3热原试验
1.3.3.1 浸提液的制备：将丹参纳米银复合材料切成30mm×5mm条状，置于去热原的25ml锥形瓶中，按受试材料3cm2：1ml氯化钠注射液的比例，取一定量的氯化钠注射液于锥形瓶中，置于37℃电热恒温培养箱中浸提72h。72h后将浸提液转移至另一去热原的锥形瓶中，调节pH值为7.0左右，4℃保存备用。以上过程均在洁净工作台上按无菌操作要求进行。
1.3.3.2 热原检查法：根据GB/T16175-1996热原试验，在试验前7天选3只家兔，雌雄不限，雌兔无孕，且测温前7天内应在同一环境条件用同一饲料饲养，在此期间家兔体重无减轻，精神、食欲、排泄等无异常。预测体温时用肛温计插入家兔肛门，深度约6cm，时间为2min，取出肛温计并记下读数。每隔lh测量1次，共测4次，体温均在38.O～39.6℃的范围内，且最高最低体温的差数不超过0.4℃，符合热原试验要求。
3天后将家兔固定于固定器内。30min后开始第1次测量，以后每隔30min测1次，共测2次。体温之差不超过0.2℃，以此2次体温的平均值为该兔的正常体温。且当日使用家兔的体温在38.0～39.6℃的范围内，各兔间正常体温之差不超过1℃。在家兔正常体温符合要求后15min内，自耳静脉缓慢注入预热38℃丹参纳米银复合材料浸提液，剂量为l0ml/kg。注射后每隔1h测量体温1次，6次体温中最高的1次减去正常体温为试验家兔体温升高值。
1.3.4 原发性皮肤刺激试验：受试家兔6只，实验前24h，脊柱两侧各选2个3cm×3cm面积的去毛区，用8％的硫化钠溶液去毛，间距l0cm。用75％(v/V)乙醇消毒背部去毛区，用2.5cm×2.5cm滤纸块浸泡于丹参纳米银复合材料的浸提液中至饱和，贴敷于试验部位。浸提介质生理盐水作为阴性对照，3.5％甲醛溶液作为阳性对照。材料贴敷于皮肤后，立即用3cm×3cm纱布块覆盖，最外层用胶布固定。贴敷固定24h后，移去贴敷物，用温水清洁贴敷区l并吸干，观察移去斑贴物后24、48和72h皮肤的红斑及水肿情况。计算原发刺激指数(PII)，参考文献标准进行记分并评价。
1.3.5 皮内刺激试验：实验前24h，受试家兔脊柱两侧各剪剃5cm×25cm区域兔毛，应避免损伤皮肤。用75％(V/V)乙醇消毒暴露的皮肤。在兔脊柱两侧各选择10个点，每点间隔2cm，每点皮内注射剂量0.2ml。一侧前5点注射丹参纳米银复合材料生理盐水浸提液，后5点注射同批阴性对照生理盐水；另一侧前后5点分别注射丹参纳米银复合材料植物油浸提液和阴性对照植物油。注射后24、48、72h观察注射局部及周围皮肤组织反应，参考文献标准进行记分并评价。
1.3.6 急性全身毒性试验：将健康小白鼠随机分为试验材料组和对照两组，每组5只。试验组动物由尾静脉注射丹参纳米银复合材料生理盐水浸提液，剂量为50ml/kg。对照组动物由尾静脉注射同批号的生理盐水，剂量为50ml/kg。注射后于24、48、72h观察记录试验和对照组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数。观察指标参考文献标准。
1.3.7 银含量测定；0.2kg左右健康成年SD大鼠48只，随机分为正常对照组(12只)，治疗I组(创面外敷丹参纳米银复合材料，12只)、治疗II组(创面外敷纳米银仿生敷料，12只)、治疗III组(创面外敷磺胺嘧啶银粉剂，12只)。治疗I组、II组、III组sD大鼠用取皮刀造成10％～13％TBSA(Tota]Body Surface Area)深II度切割伤。
治疗I组、治疗II组和治疗III组在治疗前和治疗后2天、4天、5天、7天、13天和16天眼眶采血，采用火焰原子吸收分光光度法测定sD大鼠血液中银的含量。当创面恢复半个月后处死SD大鼠，取其肝、脑、肾，用火焰原子吸收分光光度法测定各组织中的银含量。
1.3.8 统计学处理：银含量检测数据，用State 7.0统计软件进行分析。
2 结果
2.1 无菌试验结果：培养5天后，接种有丹参纳米银复合材料的需氧一厌氧菌培养管、环境监测的阴性对照管无菌生长，阳性对照管有菌生长；培养7天后，接种有丹参纳米银复合材料的真菌培养管、环境监测的阴性对照管无菌生长，阳性对照管有菌生长，说明该材料无菌。
2.2 热原试验结果：由表l可见，3只家兔体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.4℃，说明该材料无热原。
2.3 原发性皮肤刺激试验结果：由表2可见，丹参纳米银复合材料浸提液贴敷家兔皮肤未见红斑，无水肿形成，说明该材料对家兔皮肤无刺激性。
2.4 皮内刺激试验结果：表3为皮内刺激试验的结果，可见丹参纳米银复合材料无皮内刺激反应。
2.5 急性全身毒性试验结果：急性全身毒性试验结果见表4。
2.6 全血中银含量的变化：从表5中可以看到丹参纳米银组、纳米银仿生敷料组各个时点血银的含量明显比磺胺嘧啶银组低，丹参纳米银组、纳米银仿生敷料组全血银含量无差异(P＞O.05)。丹参纳米银组、纳米银仿生敷料组银含量最高是正常水平的7倍，而磺胺嘧啶银组高达26倍。第13天，丹参纳米银组、纳米银仿生敷料组SD大鼠血银含量基本恢复正常水平(与正常组银含量0.07±0.03/zg/g相比，P＞0.05)，而此时磺胺嘧啶银组SD大鼠银含量是正常全血银的5倍(P＜0.01)。
2.7 各组织中的银含量：正常sD大鼠肝、脑、肾及血中银含量无统计学意义(p＞0.05)。对深II度切割伤大鼠使用丹参纳米银复合材料、纳米银仿生敷料和磺胺嘧啶银后，各组织银含量都有不同程度的升高，其中肝银含量升高最多，其次为肾，说明肝脏对银的吸收最多，因此如过量吸收会首先造成对肝脏的损害。另外，磺胺嘧啶银组中各组织的银含量明显高于丹参纳米银组、纳米银仿生敷料组，其中磺胺嘧啶组肝脏中银含量是正常的近100倍(P＜0.01)，有统计学意义。
3 讨论
纳米产品在医学生物学领域已经得到广泛的应用，应用前景十分广阔。本文对自制的丹参纳米银仿生敖料进行了初步的安全性评价，主要有无菌、热原及银在体内的分布、蓄积情。试验证实丹参纳米银复合材料无菌、无热原、无皮肤刺激、无皮内刺激作用。同时因银如过量吸收会造成机体的损害，我们用火焰原子吸收分光光度法对SD大鼠血液及肝、脑、肾等各器官的银含量进行测定，发现用该复合材料的治疗组大鼠比磺胺嘧啶银组大鼠对银的吸收少。其原因为：银发挥生物活性，必须以溶液形式存在，如：Ag+或Ag+Ag+通常存在于硝酸银、磺胺嘧啶银和其它银离子化合物中。Ag°是存在于金属或晶体(包括纳米晶体)中，不带电荷的存在形式。在溶液中，它以亚晶体形式存在，小于8个原子的大小。硝酸银、磺胺嘧啶银在浓度大于3200ppm时释放银离子，但是大部分都因形成化学复合物而快速失活。而纳米银提供Ag°形式的银，与离子形式相比较，这种形式的银大部分不与卤化物结合，在有机物质中灭活的速度大大降低，有效的银相对更多。因此，在达到同样的治疗效果时，机体对纳米银的吸收更少，减小了银中毒的可能性，提高了使用的安全性。
编辑 张惠娟
基金项目：江苏省科学技术厅社会发展项目(BS2005030)，江苏省人事厅“六大人才高峰”资助项目，江苏省“青蓝工程”学术带头人项目，江苏省教育厅高新技术项目(JH03－041)及自然科学项目(03KJBl50107，s30016)
通讯作者l：潘立群，教授，主任医师，博士研究生导师：E－mail：dexuansir@hotmail.com
通讯作者2：顾海鹰，教授，博士研究生导师；E－mail：hyguOntu.edu.cn：guhy99@21cn.com