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摘要 以蝴蝶兰大红袍花梗经诱导萌发生成的丛生芽为试验材料，对培养温度、活性炭、椰子汁和转接周期4个因素设置正交试验，比较不同处理对丛生芽增殖过程中抑制褐化的效果，筛选出抑制褐化的最优方法，为其工厂化生产提供理论参考。结果表明，活性炭能显著抑制褐化且对褐化的影响最大，各因素对褐化影响效应大小排序为活性炭>转接周期>温度>椰子汁；活性炭1.0 g/L、转接周期10 d、温度25 ℃、椰子汁浓度150 mL/L为抑制褐化的最优处理。
关键词 蝴蝶兰；组织培养；褐化抑制；活性炭
中图分类号 S682.31 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）14-0137-02
Abstract To provide theoretical reference for the factory production，used shoots induced from pedicels germination of Phalaenopsis amabilis Big Red Robe as experimental material，culture temperature，concentration of AC，coconut juice concentration and switching cycle were set up to carry out the orthogonal test，and effect of different treatment on the inhibition of tissue-browning effect of the proliferation of cluster buds was compared to screen the optimal method to inhibit tissue-browning.The results showed that AC could significantly inhibit browning and had the greatest influence on browning.The effects of various factors on the browning effect were sorted by the AC concentration>switching cycle>temperature>coconut juice concentration.The optimum treatment for browning inhibition was AC 1.0 g/L，switching cycle 10 d，temperature 25 ℃ and coconut juice concentration 150 mL/L.
Key words Phalaenopsis amabilis；tissue culture；inhibition of tissue-browning；active carbon
蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）为兰科（Orchidaceae）蝴蝶兰属（Phalaenopsis）植物，因花形似蝶而得名[1]。其花形奇特、花色艳丽、花期持久，素有“兰中皇后”之美誉，极具观赏价值和经济价值，在国内外花卉市场上深受欢迎[2]。蝴蝶兰属于气生根植物，喜高温高湿和半阴环境，原产于热带、亚热带雨林地区，在我国台湾和东南亚等地均有分布[3]。由于蝴蝶兰属于单茎性气生兰，在自然条件下很难进行分株繁殖；且种子因发育不完全而极难萌发[4]，难以满足日益增长的市场需求，所以目前生产中广泛应用的繁殖方式主要是组织培养[5]。在蝴蝶兰组培过程中，培养材料褐化很常见，一直是蝴蝶兰组培快繁中困扰人心的问题。本研究在前人报道的基础上，以蝴蝶兰大红袍花梗经诱导萌发生成的丛生芽为试验材料，比较不同处理对丛生芽增殖过程中抑制褐化的效果，筛选出抑制褐化的最优处理，以期为蝴蝶兰大红袍组培工厂化生产提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用蝴蝶兰大红袍花梗经诱导萌发生成的长约2 cm且生长势一致的丛生芽作为试验材料。
1.2 试验方法
试验所有处理均采用B5基本培养基，附加6-BA 5.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L、蔗糖20 g/L、琼脂6.5 g/L，pH值5.6。培养环境光照16 h/d，光强1 500～2 000 lx，湿度65%左右。
本试验对培养温度、活性炭、椰子汁和转接周期4个因素各设置3个水平，进行L9（34）正交试验（表1、2）。每瓶接种1个芽，每个处理接种20瓶，3次重复。接种30 d后统计褐化抑制率。
1.3 统计方法
褐化率（%）=褐化芽数/（接种芽总数-污染芽数）×100；
褐化抑制率（%）=1-褐化率。
用Excel进行原始数据的处理，用DPS数据处理软件进行其他相关的分析。
2 结果与分析
试验数据经直观分析、方差分析及Duncan多重比较（表3、4、5），结果表明，培养温度、活性炭、椰子汁和转接周期4个因素对蝴蝶兰组培褐化均有影响。活性炭能显著抑制褐化的发生，且对褐化的影响最大。转接周期对褐化的影响次之，且缩短转接周期能显著抑制褐化的发生。培养温度在20～25 ℃之间时褐化程度明显轻于30 ℃時，说明低温能有效抑制褐化的发生。椰子汁对抑制褐化也有一定的作用。这4个因素的抑制褐化效应大小排序为活性炭>转接周期>温度>椰子汁。
根据同一因素不同水平的差异显著性比较，可得出A1B2C2D1、A1B2C2D2、A2B2C2D1和A2B2C2D2这4个处理抑制褐化的效果明显好于其他处理。在因素A（培养温度）和D（转接周期）水平取值上，考虑工厂化生产条件和成本因素，当以取值A2和D2为好。因此，A2B2C2D2处理为抑制褐化的最优处理，即培养温度25 ℃、活性炭1.0 g/L、椰子汁浓度150 mL/L、转接周期10 d。 3 讨论
近年来，前人[6-7]对植物组培中出现的褐化现象进行了大量的研究，认为褐化的发生主要是由于刀片伤害切口处细胞，受伤细胞分泌多酚氧化酶（PPO）作用于天然底物酚类物质形成褐色的醌类物质，扩散到培养基中，抑制其他酶活性，毒害整个外植体。褐化程度与培养温度、转接周期、吸附剂和有机添加物等因素具有很大的关系。适当的温度、适时转接、适宜的吸附剂和有机添加物等因素结合起来可以有效地减轻褐化对植物组培的影响。培养温度对褐化的影响较大，高温能促进PPO的活性，促进酚类物质氧化形成醌类物质，增加褐化程度，而低温能减轻褐化。张红[8]在对库拉索芦荟的组培研究中认为25 ℃培养可以减少褐化。唐德华等[9]研究也表明当温度上升到30 ℃时，褐化率显著提高，且褐化时间明显变快，较适合的温度为20～25 ℃。
活性炭具有强大的吸附能力，可以吸附褐色有毒物质，减少有害物质对接种外植体的影响，对遏制褐化的产生有着显著效果。刘真华等[10]、王立娅等[11]、朱雪征[12]、王 蕾等[13]的研究充分证明了这一点。
經常更换新鲜培养基，是防止褐化最直接有效的方法。陈瑶瑶等[14]在研究中采用缩短转接周期，及时转换新鲜培养基的措施，有效抑制了褐化的产生。
有机添加物对褐化也有一定的抑制作用。姚丽娟等[15]研究发现在培养基中添加10%椰子汁，能促进原球茎的生长，减少原球茎增殖过程中的褐变。唐德华等[9]研究也发现有机添加物对抑制花梗腋芽和叶片褐化的效果明显，其中以椰子汁、马铃薯泥和香蕉泥的抑制效果最好。
本试验在对蝴蝶兰组培的研究中，活性炭能显著抑制褐化且对褐化的影响最大，转接周期对褐化的影响次之，各因素对褐化影响效应大小排序为活性炭>转接周期>温度>椰子汁；活性炭1.0 g/L、转接周期10 d、温度25 ℃、椰子汁浓度150 mL/L，为抑制褐化的最优处理，这与前人的研究结果基本一致。
4 参考文献
[1] 卢思聪.中国兰与洋兰[M].北京：金盾出版社，1994.
[2] 王怀宇.蝴蝶兰的快速无性繁殖[J].园艺学报，1989，16（1）：73-77.
[3] 曹孜义，刘国民.实用植物组织培养技术教程[M].甘肃：甘肃科学技术出版社，2002.
[4] PARK S Y，MURTHY H N，PACK K Y.Rapid propagation of Phalaeno-psis from floral stalk-derived leaves[J].In Vitro Cellular
关键词 蝴蝶兰；组织培养；褐化抑制；活性炭
中图分类号 S682.31 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）14-0137-02
Abstract To provide theoretical reference for the factory production，used shoots induced from pedicels germination of Phalaenopsis amabilis Big Red Robe as experimental material，culture temperature，concentration of AC，coconut juice concentration and switching cycle were set up to carry out the orthogonal test，and effect of different treatment on the inhibition of tissue-browning effect of the proliferation of cluster buds was compared to screen the optimal method to inhibit tissue-browning.The results showed that AC could significantly inhibit browning and had the greatest influence on browning.The effects of various factors on the browning effect were sorted by the AC concentration>switching cycle>temperature>coconut juice concentration.The optimum treatment for browning inhibition was AC 1.0 g/L，switching cycle 10 d，temperature 25 ℃ and coconut juice concentration 150 mL/L.
Key words Phalaenopsis amabilis；tissue culture；inhibition of tissue-browning；active carbon
蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）为兰科（Orchidaceae）蝴蝶兰属（Phalaenopsis）植物，因花形似蝶而得名[1]。其花形奇特、花色艳丽、花期持久，素有“兰中皇后”之美誉，极具观赏价值和经济价值，在国内外花卉市场上深受欢迎[2]。蝴蝶兰属于气生根植物，喜高温高湿和半阴环境，原产于热带、亚热带雨林地区，在我国台湾和东南亚等地均有分布[3]。由于蝴蝶兰属于单茎性气生兰，在自然条件下很难进行分株繁殖；且种子因发育不完全而极难萌发[4]，难以满足日益增长的市场需求，所以目前生产中广泛应用的繁殖方式主要是组织培养[5]。在蝴蝶兰组培过程中，培养材料褐化很常见，一直是蝴蝶兰组培快繁中困扰人心的问题。本研究在前人报道的基础上，以蝴蝶兰大红袍花梗经诱导萌发生成的丛生芽为试验材料，比较不同处理对丛生芽增殖过程中抑制褐化的效果，筛选出抑制褐化的最优处理，以期为蝴蝶兰大红袍组培工厂化生产提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用蝴蝶兰大红袍花梗经诱导萌发生成的长约2 cm且生长势一致的丛生芽作为试验材料。
1.2 试验方法
试验所有处理均采用B5基本培养基，附加6-BA 5.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L、蔗糖20 g/L、琼脂6.5 g/L，pH值5.6。培养环境光照16 h/d，光强1 500～2 000 lx，湿度65%左右。
本试验对培养温度、活性炭、椰子汁和转接周期4个因素各设置3个水平，进行L9（34）正交试验（表1、2）。每瓶接种1个芽，每个处理接种20瓶，3次重复。接种30 d后统计褐化抑制率。
1.3 统计方法
褐化率（%）=褐化芽数/（接种芽总数-污染芽数）×100；
褐化抑制率（%）=1-褐化率。
用Excel进行原始数据的处理，用DPS数据处理软件进行其他相关的分析。
2 结果与分析
试验数据经直观分析、方差分析及Duncan多重比较（表3、4、5），结果表明，培养温度、活性炭、椰子汁和转接周期4个因素对蝴蝶兰组培褐化均有影响。活性炭能显著抑制褐化的发生，且对褐化的影响最大。转接周期对褐化的影响次之，且缩短转接周期能显著抑制褐化的发生。培养温度在20～25 ℃之间时褐化程度明显轻于30 ℃時，说明低温能有效抑制褐化的发生。椰子汁对抑制褐化也有一定的作用。这4个因素的抑制褐化效应大小排序为活性炭>转接周期>温度>椰子汁。
根据同一因素不同水平的差异显著性比较，可得出A1B2C2D1、A1B2C2D2、A2B2C2D1和A2B2C2D2这4个处理抑制褐化的效果明显好于其他处理。在因素A（培养温度）和D（转接周期）水平取值上，考虑工厂化生产条件和成本因素，当以取值A2和D2为好。因此，A2B2C2D2处理为抑制褐化的最优处理，即培养温度25 ℃、活性炭1.0 g/L、椰子汁浓度150 mL/L、转接周期10 d。 3 讨论
近年来，前人[6-7]对植物组培中出现的褐化现象进行了大量的研究，认为褐化的发生主要是由于刀片伤害切口处细胞，受伤细胞分泌多酚氧化酶（PPO）作用于天然底物酚类物质形成褐色的醌类物质，扩散到培养基中，抑制其他酶活性，毒害整个外植体。褐化程度与培养温度、转接周期、吸附剂和有机添加物等因素具有很大的关系。适当的温度、适时转接、适宜的吸附剂和有机添加物等因素结合起来可以有效地减轻褐化对植物组培的影响。培养温度对褐化的影响较大，高温能促进PPO的活性，促进酚类物质氧化形成醌类物质，增加褐化程度，而低温能减轻褐化。张红[8]在对库拉索芦荟的组培研究中认为25 ℃培养可以减少褐化。唐德华等[9]研究也表明当温度上升到30 ℃时，褐化率显著提高，且褐化时间明显变快，较适合的温度为20～25 ℃。
活性炭具有强大的吸附能力，可以吸附褐色有毒物质，减少有害物质对接种外植体的影响，对遏制褐化的产生有着显著效果。刘真华等[10]、王立娅等[11]、朱雪征[12]、王 蕾等[13]的研究充分证明了这一点。
經常更换新鲜培养基，是防止褐化最直接有效的方法。陈瑶瑶等[14]在研究中采用缩短转接周期，及时转换新鲜培养基的措施，有效抑制了褐化的产生。
有机添加物对褐化也有一定的抑制作用。姚丽娟等[15]研究发现在培养基中添加10%椰子汁，能促进原球茎的生长，减少原球茎增殖过程中的褐变。唐德华等[9]研究也发现有机添加物对抑制花梗腋芽和叶片褐化的效果明显，其中以椰子汁、马铃薯泥和香蕉泥的抑制效果最好。
本试验在对蝴蝶兰组培的研究中，活性炭能显著抑制褐化且对褐化的影响最大，转接周期对褐化的影响次之，各因素对褐化影响效应大小排序为活性炭>转接周期>温度>椰子汁；活性炭1.0 g/L、转接周期10 d、温度25 ℃、椰子汁浓度150 mL/L，为抑制褐化的最优处理，这与前人的研究结果基本一致。
4 参考文献
[1] 卢思聪.中国兰与洋兰[M].北京：金盾出版社，1994.
[2] 王怀宇.蝴蝶兰的快速无性繁殖[J].园艺学报，1989，16（1）：73-77.
[3] 曹孜义，刘国民.实用植物组织培养技术教程[M].甘肃：甘肃科学技术出版社，2002.
[4] PARK S Y，MURTHY H N，PACK K Y.Rapid propagation of Phalaeno-psis from floral stalk-derived leaves[J].In Vitro Cellular