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摘要[目的] 构建细菌性条斑病菌诱导下的水稻抗病均一化差减cDNA文库，对获得的差异表达ESTs进行生物信息学及抗病相关基因的表达分析。 [方法]以水稻IR26（Tester）和两优培九（Driver）幼苗5～6叶期叶片为材料，采用双链特异性核酸酶（DSN）介导的均一化消减杂交技术，构建细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻抗病相关基因差减cDNA文库，以pLBF和pLBR为引物，通过菌液PCR扩增对差减文库的质量进行检测。[结果] cDNA文库的插入片段分布在 0.5～2.0 kb，平均大小约为1.0 kb，重组率达 95%。序列测定分析发现，随机挑取的504个克隆中有98 条差异表达基因；经 BLAST 比对和GO 注释发现，59 条序列具有同源基因，分别参与信号转导、能量代谢、过敏性坏死反应、防卫反应等；另外 39 条序列无相似基因，有待进一步研究。通过实时荧光定量PCR发现，从该文库中分离得到的OsNDPK4参与细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻防卫反应。[结论]水稻受细菌性条斑病菌侵染的 cDNA文库质量较好，为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定基础。
关键词细菌性条斑病；水稻；双链特异性核酸酶（DSN）；均一化差减杂交；荧光定量PCR
中图分类号S432.1文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）02-188-04
Abstract [Objective] A normalized subtractive cDNA library of rice inoculated with Xanthomonas oryzae pv.oryzacola JH01 was constructed，the expression analysis of biological information and disease resistance related genes was conducted on obtained differential expression of ESTs.[Method] In this study，using seedling leaves of rice ‘IR26’ （Tester） and ‘Liangyoupeijiu’ （Driver） as experimental materials，a subtracted cDNA library of rice inoculated by Xanthomonas oryzae JH01was constructed by the method based on subtractive hybridization of the DSN （duplexspecific nuclease） mediated subtractive hybridization.The quality of the subtractive library was detected by PCR amplification using primers pLBF and pLBR.[Result] The results demonstrated that the sizes of inserted fragments in the vector were between 0.52.0 kb，that the average size was about 1kb，and that 95% of the library clones were recombinants.504 clones were randomly selected，and 98 genes were obtained after clearing pollution，redundant，low quality sequences，and 59 genes were found to have homologous genes in analysis by BLAST.Gene ontology showed that 59 genes were related with resistance signals transduction，elementary metabolic，hypersensitive response，defense response et al.The other 39 sequences had no similar genes，which need further study.By realtime fluorescent quantitative PCR，OsNDPK4 isolated from the library was found to be involved in defense responses in rice induced by Xanthomonas oryzae JH01.[Conclusion] The above suggests that the constructed cDNA library of rice is of good quality and of use for isolation of interacting proteins.
Key wordsBacterial leaf streak； Rice； Duplexspecific nuclease （DSN）； Normalized subtractive hybridization； Realtine fluorescence quantitative PCR
稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xooc）引起的水稻细菌性条斑病（Rice bacteria leaf streak，简称细条病或条斑病）是水稻上的重要细菌病害，具高度传染性，一旦发病很难控制。1955年在广东省首次发现该病，现已成为我国南方稻区的重要病害[1-2]。对于水稻细菌性条斑病的防治，目前以化学防治为主，然而农药的大量使用不仅会造成环境污染，也会对人类健康产生危害。利用水稻自身的抗病相关基因培育抗病品种，则可以从根本上解决上述问题。而构建抗病差减全长cDNA文库是目前寻找水稻抗细菌性条斑病基因的有效途径之一[3]。 双链特异性核酸酶（Duplexspecific nuclease）介导的均一化差减杂交是继抑制性差减杂交（Suppression subtractive hybridizatiom，SSH）之后一种新的差异表达基因筛选技术[4]。该技术是基于双链特异性的核酸酶分子丰度均等化策略和抑制性消减杂交的杂交方法而建立的[4-6]。该技术根据SMART原理和体外转录技术，分别获取遗传背景相似的2组试验材料（Tester和Driver）的全长cDNA和RNA；将两者充分杂交，杂交产物经过DSN 酶解；酶解产物经PCR扩增，差异表达片段（即没有被酶解的单链cDNA）得到有效富集。此技术不仅可以筛选表达量很低的差异表达基因，而且可以获得基因的全长cDNA，后续研究中无需进行基因的扩增等操作，弥补了SSH技术的缺点，是发现新基因、研究基因功能的重要手段[4，7]。笔者利用DSN介导的均一化差减杂交技术构建了细菌性条斑病菌诱导下的水稻抗病均一化差减cDNA文库，对获得的差异表达ESTs进行生物信息学分析及抗病相关基因的表达分析。
1材料与方法
1.1水稻品种和病原菌株
水稻两优培九和IR26由浙江省金华市植物保护站惠赠，黄单胞菌稻生致病变种JH01为浙江师范大学分子生物学实验室保存。水稻采用国际IRRI水稻培养液培养至幼苗5～6叶期；菌株JH01于NA固体培养基和液体培养基28 ℃培养。
1.2引物及其序列消减杂交中所用引物及其序列见表1。
1.3水稻接种病原菌后RNA的提取
用NB 液体培养基将JH01菌液稀释至约3×108 cfu/mL （OD600=0.6），选择水稻第3、4 片叶，用改良的针刺接种法接种[5]，每片水稻叶片沿主脉两侧对称接种10个孔，每个水稻品种接种300株；用NB 液体培养基作为阴性对照接种水稻叶片。接种后，28 ℃弱光照24 h条件下培养。接种后0、12、24、48、72、84、96 h剪下水稻叶片称重，锡纸包裹并做好标记，经液氮速冻处理后储存于-80 ℃超低温冰箱。病原接种水稻IR26的样品为处理组（Tester），接种水稻两优培九的样品为对照组（Driver）。采用PureLink RNA Mini Kit（Invitrogen）提取水稻叶片的总RNA。用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，1.0%琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性检测，样品置于-80 ℃冰箱中保存。
1.4文库的建立
1.4.1全长cDNA合成。按照 SuperScript II（Invitrogen） 使用手册合成cDNA第一条链。在 200 μL PCR管中加入对照组（Driver）/处理组（Tester）总RNA样品 4.00 μL（1.5 μg），然后依次加入0.50 μL TsOligo，0.50 μL Tspa，1.00 μL dNTPs（10 mmol/L），2.00 μL 5×FirstStrand Buffer（Invitrogen），1.00 μL DTT，0.25 μL RNase inhibitor（40 U/μL），0.75 μL SuperScript II RTase （200 U/μL） （Invitrogen），共计10.00 μL体系。RT反应条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。以此产物为模板，采用引物 SP6T7 和 3′AP 进行双链全长cDNA合成反应，反应条件：94 ℃，2.0 min；X个循环（95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 6 min）；X代表20、24、28、32个循环。PCR扩增体系后，采用PCR Cleanup Kit（Qiagen）进行纯化回收。
1.4.2体外转录和Tester逆转录。按照RiboMaxTM Large Scale RNA Production SystemSP6（Promega ）和ScriptMAXTM Thermo T7 Transcription Kit（Toyobo）操作手册，分别将“1.4.1”纯化的Tester和Driver双链cDNA进行体外转录。加入DNase I消化模板基因组、RNeasy MinElute Cleanup Kit（Qiagen）对消化产物进行纯化。将纯化后的Tester RNA利用引物 T7oligodT逆转录成 cDNA。
1.4.3杂交反应和DSN酶消化反应。将“1.4.2”中得到的tester cDNA与Driver RNA按照10.0 μL体系进行消减杂交：1.0 μL 10×Hybridization buffer，2.0 μL Tester cDNA（体外转录）；3.0 μL Driver RNA（15 μg），加入DEPCH2O补足至10.0 μL。反应条件：88 ℃充分变性2 min；55 ℃杂交16 h。
在新管中配制20.0 μL酶切体系[2.0 μL 10×DSN buffer，1.0 μL DSN（0.2 U/μl，Evrogen），17.0 μL DEPCH2O）]，预热至65 ℃后加入上述消减杂交产物10.0 μL，于65 ℃下反应30 min，最后加入1.5 μL EDTA（100 mmol/L）以及20.0 μL SDW，68 ℃10 min终止反应。
1.4.4均一化消减产物的扩增。将酶切后得到的消减杂交产物通过3轮PCR 进行富集，具体方法参照文献[6]。
1.4.5扩增产物的连接、转化和筛选。600 bp以上的PCR扩增产物片段使用PCR Gel extraction kit（Qiagen）进行切胶回收，并使用pLB零背景快速克隆试剂盒（天根生物）进行差异表达片段与pUCmT 载体的连接，进而进行重组质粒的转化和蓝白斑筛选，即构成细菌性条斑菌JH01诱导的水稻抗病基因差减文库。通过pLBF和pLBR引物进行PCR扩增筛选，750 bp以上的扩增片段送上海英潍捷基生物技术有限公司进行序列测序。 1.5测序结果的分析和GO注释
利用VecScreen、EditSeq和SepMan进行序列的识别、去除和拼接；将整理后的序列在GenBank进行同源性比对分析和GO 注释。
1.6差异基因实时荧光定量PCR鉴定
提取接种细菌性条斑病后不同时间段（12、24、36、72 h）的水稻（IR26和两优培九）叶片，按照“1.3”步骤提取总RNA，进而反转录合成第一链cDNA。
为了进一步验证文库的可靠性，从测序结果中筛选OsNDPK4基因设计特异引物OsNDPK4a和OsNDPK4s（表1），以水稻肌动蛋白基因（actin1基因）为内参，病菌诱导的水稻cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析。反应体系（20.0 μL）：7.0 μL ddH2O，10.0 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM，0.8 μL PCRF（10 μmol/L），0.8 μL PCRR （10 μmol/L），1.0 μL 模板cDNA，0.4 μL Rox Reference Dye（50×）。熔点曲线分析条件：95 ℃，15 s；65 ℃，1 min；95 ℃，15 s。荧光定量PCR反应条件：95 ℃ 35 s；95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，45个循环。以actin1 基因作为参照基因进行模板初始量的调整。每个样品重复3 次，以2-ΔΔCt进行各个基因相对表达水平的统计分析。
2结果与分析
2.1样品总RNA的提取
提取的水稻总RNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪检测。结果显示，总RNA呈现 28S 和18S 两条特异性条带（图 1）；OD260/280均在1.9～2.0。说明所提取的 RNA质量较好，可用于后续试验。
2.2水稻cDNA质量的检测
为保证ds cDNA 合成质量，分别采用20、24、28、32个循环对反转录得到的cDNA进行PCR扩增，以确定扩增最合适的循环数。由图2可知，在20个循环条件下看不出有弥散性条带；24个循环条件下出现弥散性条带但不是很清晰；28个循环条件下可以非常清晰地看出弥散性条带且非常亮。而且Driver 和Tester 的ds cDNA 均分布在 0.2～0.3 kb，表明不同大小和丰度的总RNA均得到有效的反转录和扩增，合成的ds cDNA质量较高。
2.4消减文库质量检测
将得到的差异表达的cDNA与pLB零背景快速克隆试剂盒（天根生物）进行连接，构建消减文库。分2批从消减文库中随机挑选共504条（ZW1～ZW264和W1～W240）进行克隆，进而通过菌液PCR进行差减文库质量检测。扩增结果表明，约95%的克隆可以扩增出有效片段，大小主要分布在0.5～2.0 kb（图4）。说明插入片段完整性较高，所构建文库质量符合测序要求。
2.5生物信息学分析
通过对504条基因序列进行去冗、拼接后，最终获得98条差异显示序列。BLAST比对发现59 条序列具有同源基因，占差异显示序列的60.2%。GO注释分析发现，59条基因分别参与防卫反应、光合作用、电子链传递、细胞间信号转导、糖的代谢、次生代谢等。另外39条序列无相似基因，且尚未有相关功能的报道。
2.6OsNDPK4基因荧光定量表达分析
为了进一步鉴定文库的质量，在已构建的DSN介导的水稻抗细菌性条斑病均一性消减文库中挑选OsNDPK4，通过实时荧光定量PCR分析该基因在不同水稻中的表达情况，结果见图6。由图6可知，接种细菌性条斑病菌后72 h内，基因OsNDPK4受诱导在抗病和感病品种中均表达，且表达量随时间的延长而提高；在72 h时，基因OsNDPK4在感病品种中表达量下降，在抗病品种中的表达量持续升高。
3结论与讨论
该研究采用DSN介导的均一化消减杂交技术构建的cDNA文库中差异片段大小分布于0.5～2.0 kb，平均大小为1.0 kb左右，文库质量较好。文库中很少有大于2.0 kb的cDNA片段，其原因可能是试验过程中的PCR扩增具有选择性，导致某些长片段基因丢失，最终获得98条独立的差异表达基因。经 BLAST同源性比对分析表明，60.2%差异表达基因具有同源基因。由此说明，DSN介导的均一化消减杂交方法应用于细菌性条斑病菌诱导的水稻抗病差异表达基因的筛选可行、有效，且能获得全长cDNA。
NDPK（Nucleoside Diphosphate Kinase1）是一个普遍存在的酶类，研究发现，其从细菌到哺乳动物中均起着重要的调控作用。如NDPK通过改变GTP在相邻G蛋白中的存在来
调节G蛋白的活性[8-9]，NDPK还与肿瘤转移的抑制[10]和果蝇的发育有关[11]。Akihiko等[12]对水稻中已报道的NDPK基因即OsNDPK1、OsNDPK2和OsNDPK3进行了亚细胞定位和组织特异性基因表达，结果发现它们分别定位于细胞溶质、质体和线粒体中，在叶片和叶鞘中均有表达。BR上调OsNDPK1的表达，OsNDPK1调控植物的抗病性和细胞分裂并正调控BR的信号转导过程[13]。该研究在构建的水稻抗
细菌性条斑病均一性消减文库差异表达ESTs中，获得了
OsNDPK4全长cDNA 序列。荧光定量PCR结果表明，OsNDPK4参与了细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻防卫反应。这说明该研究构建的经Xooc侵染诱导的水稻cDNA文库，为
更多抗病基因的分离和功能研究奠定了基础。
参考文献
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关键词细菌性条斑病；水稻；双链特异性核酸酶（DSN）；均一化差减杂交；荧光定量PCR
中图分类号S432.1文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）02-188-04
Abstract [Objective] A normalized subtractive cDNA library of rice inoculated with Xanthomonas oryzae pv.oryzacola JH01 was constructed，the expression analysis of biological information and disease resistance related genes was conducted on obtained differential expression of ESTs.[Method] In this study，using seedling leaves of rice ‘IR26’ （Tester） and ‘Liangyoupeijiu’ （Driver） as experimental materials，a subtracted cDNA library of rice inoculated by Xanthomonas oryzae JH01was constructed by the method based on subtractive hybridization of the DSN （duplexspecific nuclease） mediated subtractive hybridization.The quality of the subtractive library was detected by PCR amplification using primers pLBF and pLBR.[Result] The results demonstrated that the sizes of inserted fragments in the vector were between 0.52.0 kb，that the average size was about 1kb，and that 95% of the library clones were recombinants.504 clones were randomly selected，and 98 genes were obtained after clearing pollution，redundant，low quality sequences，and 59 genes were found to have homologous genes in analysis by BLAST.Gene ontology showed that 59 genes were related with resistance signals transduction，elementary metabolic，hypersensitive response，defense response et al.The other 39 sequences had no similar genes，which need further study.By realtime fluorescent quantitative PCR，OsNDPK4 isolated from the library was found to be involved in defense responses in rice induced by Xanthomonas oryzae JH01.[Conclusion] The above suggests that the constructed cDNA library of rice is of good quality and of use for isolation of interacting proteins.
Key wordsBacterial leaf streak； Rice； Duplexspecific nuclease （DSN）； Normalized subtractive hybridization； Realtine fluorescence quantitative PCR
稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xooc）引起的水稻细菌性条斑病（Rice bacteria leaf streak，简称细条病或条斑病）是水稻上的重要细菌病害，具高度传染性，一旦发病很难控制。1955年在广东省首次发现该病，现已成为我国南方稻区的重要病害[1-2]。对于水稻细菌性条斑病的防治，目前以化学防治为主，然而农药的大量使用不仅会造成环境污染，也会对人类健康产生危害。利用水稻自身的抗病相关基因培育抗病品种，则可以从根本上解决上述问题。而构建抗病差减全长cDNA文库是目前寻找水稻抗细菌性条斑病基因的有效途径之一[3]。 双链特异性核酸酶（Duplexspecific nuclease）介导的均一化差减杂交是继抑制性差减杂交（Suppression subtractive hybridizatiom，SSH）之后一种新的差异表达基因筛选技术[4]。该技术是基于双链特异性的核酸酶分子丰度均等化策略和抑制性消减杂交的杂交方法而建立的[4-6]。该技术根据SMART原理和体外转录技术，分别获取遗传背景相似的2组试验材料（Tester和Driver）的全长cDNA和RNA；将两者充分杂交，杂交产物经过DSN 酶解；酶解产物经PCR扩增，差异表达片段（即没有被酶解的单链cDNA）得到有效富集。此技术不仅可以筛选表达量很低的差异表达基因，而且可以获得基因的全长cDNA，后续研究中无需进行基因的扩增等操作，弥补了SSH技术的缺点，是发现新基因、研究基因功能的重要手段[4，7]。笔者利用DSN介导的均一化差减杂交技术构建了细菌性条斑病菌诱导下的水稻抗病均一化差减cDNA文库，对获得的差异表达ESTs进行生物信息学分析及抗病相关基因的表达分析。
1材料与方法
1.1水稻品种和病原菌株
水稻两优培九和IR26由浙江省金华市植物保护站惠赠，黄单胞菌稻生致病变种JH01为浙江师范大学分子生物学实验室保存。水稻采用国际IRRI水稻培养液培养至幼苗5～6叶期；菌株JH01于NA固体培养基和液体培养基28 ℃培养。
1.2引物及其序列消减杂交中所用引物及其序列见表1。
1.3水稻接种病原菌后RNA的提取
用NB 液体培养基将JH01菌液稀释至约3×108 cfu/mL （OD600=0.6），选择水稻第3、4 片叶，用改良的针刺接种法接种[5]，每片水稻叶片沿主脉两侧对称接种10个孔，每个水稻品种接种300株；用NB 液体培养基作为阴性对照接种水稻叶片。接种后，28 ℃弱光照24 h条件下培养。接种后0、12、24、48、72、84、96 h剪下水稻叶片称重，锡纸包裹并做好标记，经液氮速冻处理后储存于-80 ℃超低温冰箱。病原接种水稻IR26的样品为处理组（Tester），接种水稻两优培九的样品为对照组（Driver）。采用PureLink RNA Mini Kit（Invitrogen）提取水稻叶片的总RNA。用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，1.0%琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性检测，样品置于-80 ℃冰箱中保存。
1.4文库的建立
1.4.1全长cDNA合成。按照 SuperScript II（Invitrogen） 使用手册合成cDNA第一条链。在 200 μL PCR管中加入对照组（Driver）/处理组（Tester）总RNA样品 4.00 μL（1.5 μg），然后依次加入0.50 μL TsOligo，0.50 μL Tspa，1.00 μL dNTPs（10 mmol/L），2.00 μL 5×FirstStrand Buffer（Invitrogen），1.00 μL DTT，0.25 μL RNase inhibitor（40 U/μL），0.75 μL SuperScript II RTase （200 U/μL） （Invitrogen），共计10.00 μL体系。RT反应条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。以此产物为模板，采用引物 SP6T7 和 3′AP 进行双链全长cDNA合成反应，反应条件：94 ℃，2.0 min；X个循环（95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 6 min）；X代表20、24、28、32个循环。PCR扩增体系后，采用PCR Cleanup Kit（Qiagen）进行纯化回收。
1.4.2体外转录和Tester逆转录。按照RiboMaxTM Large Scale RNA Production SystemSP6（Promega ）和ScriptMAXTM Thermo T7 Transcription Kit（Toyobo）操作手册，分别将“1.4.1”纯化的Tester和Driver双链cDNA进行体外转录。加入DNase I消化模板基因组、RNeasy MinElute Cleanup Kit（Qiagen）对消化产物进行纯化。将纯化后的Tester RNA利用引物 T7oligodT逆转录成 cDNA。
1.4.3杂交反应和DSN酶消化反应。将“1.4.2”中得到的tester cDNA与Driver RNA按照10.0 μL体系进行消减杂交：1.0 μL 10×Hybridization buffer，2.0 μL Tester cDNA（体外转录）；3.0 μL Driver RNA（15 μg），加入DEPCH2O补足至10.0 μL。反应条件：88 ℃充分变性2 min；55 ℃杂交16 h。
在新管中配制20.0 μL酶切体系[2.0 μL 10×DSN buffer，1.0 μL DSN（0.2 U/μl，Evrogen），17.0 μL DEPCH2O）]，预热至65 ℃后加入上述消减杂交产物10.0 μL，于65 ℃下反应30 min，最后加入1.5 μL EDTA（100 mmol/L）以及20.0 μL SDW，68 ℃10 min终止反应。
1.4.4均一化消减产物的扩增。将酶切后得到的消减杂交产物通过3轮PCR 进行富集，具体方法参照文献[6]。
1.4.5扩增产物的连接、转化和筛选。600 bp以上的PCR扩增产物片段使用PCR Gel extraction kit（Qiagen）进行切胶回收，并使用pLB零背景快速克隆试剂盒（天根生物）进行差异表达片段与pUCmT 载体的连接，进而进行重组质粒的转化和蓝白斑筛选，即构成细菌性条斑菌JH01诱导的水稻抗病基因差减文库。通过pLBF和pLBR引物进行PCR扩增筛选，750 bp以上的扩增片段送上海英潍捷基生物技术有限公司进行序列测序。 1.5测序结果的分析和GO注释
利用VecScreen、EditSeq和SepMan进行序列的识别、去除和拼接；将整理后的序列在GenBank进行同源性比对分析和GO 注释。
1.6差异基因实时荧光定量PCR鉴定
提取接种细菌性条斑病后不同时间段（12、24、36、72 h）的水稻（IR26和两优培九）叶片，按照“1.3”步骤提取总RNA，进而反转录合成第一链cDNA。
为了进一步验证文库的可靠性，从测序结果中筛选OsNDPK4基因设计特异引物OsNDPK4a和OsNDPK4s（表1），以水稻肌动蛋白基因（actin1基因）为内参，病菌诱导的水稻cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析。反应体系（20.0 μL）：7.0 μL ddH2O，10.0 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM，0.8 μL PCRF（10 μmol/L），0.8 μL PCRR （10 μmol/L），1.0 μL 模板cDNA，0.4 μL Rox Reference Dye（50×）。熔点曲线分析条件：95 ℃，15 s；65 ℃，1 min；95 ℃，15 s。荧光定量PCR反应条件：95 ℃ 35 s；95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，45个循环。以actin1 基因作为参照基因进行模板初始量的调整。每个样品重复3 次，以2-ΔΔCt进行各个基因相对表达水平的统计分析。
2结果与分析
2.1样品总RNA的提取
提取的水稻总RNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪检测。结果显示，总RNA呈现 28S 和18S 两条特异性条带（图 1）；OD260/280均在1.9～2.0。说明所提取的 RNA质量较好，可用于后续试验。
2.2水稻cDNA质量的检测
为保证ds cDNA 合成质量，分别采用20、24、28、32个循环对反转录得到的cDNA进行PCR扩增，以确定扩增最合适的循环数。由图2可知，在20个循环条件下看不出有弥散性条带；24个循环条件下出现弥散性条带但不是很清晰；28个循环条件下可以非常清晰地看出弥散性条带且非常亮。而且Driver 和Tester 的ds cDNA 均分布在 0.2～0.3 kb，表明不同大小和丰度的总RNA均得到有效的反转录和扩增，合成的ds cDNA质量较高。
2.4消减文库质量检测
将得到的差异表达的cDNA与pLB零背景快速克隆试剂盒（天根生物）进行连接，构建消减文库。分2批从消减文库中随机挑选共504条（ZW1～ZW264和W1～W240）进行克隆，进而通过菌液PCR进行差减文库质量检测。扩增结果表明，约95%的克隆可以扩增出有效片段，大小主要分布在0.5～2.0 kb（图4）。说明插入片段完整性较高，所构建文库质量符合测序要求。
2.5生物信息学分析
通过对504条基因序列进行去冗、拼接后，最终获得98条差异显示序列。BLAST比对发现59 条序列具有同源基因，占差异显示序列的60.2%。GO注释分析发现，59条基因分别参与防卫反应、光合作用、电子链传递、细胞间信号转导、糖的代谢、次生代谢等。另外39条序列无相似基因，且尚未有相关功能的报道。
2.6OsNDPK4基因荧光定量表达分析
为了进一步鉴定文库的质量，在已构建的DSN介导的水稻抗细菌性条斑病均一性消减文库中挑选OsNDPK4，通过实时荧光定量PCR分析该基因在不同水稻中的表达情况，结果见图6。由图6可知，接种细菌性条斑病菌后72 h内，基因OsNDPK4受诱导在抗病和感病品种中均表达，且表达量随时间的延长而提高；在72 h时，基因OsNDPK4在感病品种中表达量下降，在抗病品种中的表达量持续升高。
3结论与讨论
该研究采用DSN介导的均一化消减杂交技术构建的cDNA文库中差异片段大小分布于0.5～2.0 kb，平均大小为1.0 kb左右，文库质量较好。文库中很少有大于2.0 kb的cDNA片段，其原因可能是试验过程中的PCR扩增具有选择性，导致某些长片段基因丢失，最终获得98条独立的差异表达基因。经 BLAST同源性比对分析表明，60.2%差异表达基因具有同源基因。由此说明，DSN介导的均一化消减杂交方法应用于细菌性条斑病菌诱导的水稻抗病差异表达基因的筛选可行、有效，且能获得全长cDNA。
NDPK（Nucleoside Diphosphate Kinase1）是一个普遍存在的酶类，研究发现，其从细菌到哺乳动物中均起着重要的调控作用。如NDPK通过改变GTP在相邻G蛋白中的存在来
调节G蛋白的活性[8-9]，NDPK还与肿瘤转移的抑制[10]和果蝇的发育有关[11]。Akihiko等[12]对水稻中已报道的NDPK基因即OsNDPK1、OsNDPK2和OsNDPK3进行了亚细胞定位和组织特异性基因表达，结果发现它们分别定位于细胞溶质、质体和线粒体中，在叶片和叶鞘中均有表达。BR上调OsNDPK1的表达，OsNDPK1调控植物的抗病性和细胞分裂并正调控BR的信号转导过程[13]。该研究在构建的水稻抗
细菌性条斑病均一性消减文库差异表达ESTs中，获得了
OsNDPK4全长cDNA 序列。荧光定量PCR结果表明，OsNDPK4参与了细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻防卫反应。这说明该研究构建的经Xooc侵染诱导的水稻cDNA文库，为
更多抗病基因的分离和功能研究奠定了基础。
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