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目的针对猪圆环病毒(PCV2)特点,利用TaqMan探针建立一种能够快速、准确并具有临床应用价值的PCV2检测方法。方法参照GenBank已收录PCV2ORF2,利用软件设计合成1对特异引物以及与之相匹配的特异性TapMan探针,采用PCR对PCV2衣壳蛋白部分基因进行克隆并鉴定,将纯化回收产物连接至pMT19-T载体,然后转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞,涂布至Amp+琼脂平板,筛选阳性克隆并扩大培养,进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序。采用矩阵法确定引物和探针最佳浓度。对基于TapMan探针的实时荧光定量PCR循环进行优化,筛选最佳退火温度。以100~109倍稀释的标准品为模板,进行敏感性试验。提取CSFV、PRRSV、PRV和PCV1的DNA(CSFV和CSFV在提取RNA后反转录成cDNA)作为模板,进行TapMan荧光定量PCR,检测其特异性。采用105~108倍稀释的标准品为模板进行重复性实验,其中批内和批间均重复4次,根据所得值计算变异系数。结果 PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后大小为114bp,与预期相符;测序分析PCR产物序列与参考序列同源性为100%。优化的PCR条件为:引物和探针浓度为10μmol/L,退火温度60℃。建立了PCV2TaqMan实时荧光定量PCR检测标准曲线,起始模板拷贝数为38.403,斜率为-3.69,相关系数R2为0.998,曲线呈线性。检测方法的敏感性为102拷贝/μl质粒标准品,是常规PCR检测敏感性的100倍。特异性检测显示,CSFV、PRRSV、PRV和PCV1扩增反应均阴性。重复性检测显示,PCR扩增循环阈值平均值基本一致,其变异系数均小于2%。采用TaqMan荧光定量PCR方法检测40份样品14份阳性,阳性率35.0%;普通PCR检测11份阳性,阳性率27.5%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论建立的PCV2TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有以下优点:1)敏感性高,能够用于精确计算PCV2病毒载量;2)特异性强,适用于检测PCV2与其他病原混合感染;3)用时短且可靠性强,可用于PCV2感染检测。