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摘 要 植物早期光诱导蛋白（ELIP）参与到植物逆境胁迫响应和果实成熟过程中。对棉花GhELIP1基因进行了研究分析，发现该基因全长582 bp，编码193个氨基酸，属于叶绿素a/b结合蛋白超家族。系统发育关系分析表明，GhELIP1蛋白与棉花中的其他4个ELIP蛋白亲缘关系最近，其次是可可。表达分析表明，GhELIP1基因在衰老叶片中的表达量最高，表明GhELIP1基因参与棉花叶片的衰老调控。该研究结果可为在棉花中进一步阐明GhELIP1基因的功能奠定基础，为棉花生物技术和分子育种提供优异的基因资源。
关键词 棉花；GhELIP1基因；序列；表达
中图分类号：S562；Q786 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.25.009
知网出版网址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20170908.1510.018.html 网络出版时间：2017/9/8 15：10：57
绿色植物中，叶绿素和类胡萝卜素结合在光系统中各种相关蛋白上捕获光能量。叶绿素结合蛋白有2种类型，第一类只结合叶绿素a，第二类既结合叶绿素a也结合叶绿素b。其中，第二类的叶绿素结合蛋白即为核基因编码的色素结合的集光复合体蛋白（light-harvesting complex，LHC）[1]。LHC家族蛋白由30多种不同成员组成，早期光诱导蛋白（early light-induced proteins， ELIPs）就是其中一种[2]。
ELIP蛋白最初是在豌豆中鉴定到的，它在黄化豌豆苗去黄化的早期被诱导表达，在叶绿体发育完全后停止表达[3]。随着生物技术的发展，如今ELIP蛋白已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、杨树（Populus L.）、苜蓿（Medicago L.）、茶树（Camellia sinensis）等多种植物中被鉴定[2]。ELIP蛋白有3个跨膜的α螺旋，其中螺旋Ⅰ和Ⅲ高度相似，分别对应LHCⅠ和LHCⅡ的相应区域。ELIP蛋白中的保守残基对于叶绿素a结合在LHC复合体上非常重要，目前已发现ELIP蛋白至少可以结合在4种叶绿素a分子上。LHC和ELIP的主要区别在于，ELIP蛋白只在发育的质体膜或将成熟叶片暴露在强光照下时瞬时表达。在强光照胁迫和一些其他环境胁迫（如寒冷、干旱、高温等）下， ELIP也会被诱导表达。此外，果实成熟也会诱导ELIP蛋白的合成[1， 4]。拟南芥中ELIP2的组成型表达导致叶绿体中叶绿素含量降低，伴随着类囊体中光合系统数量的减少，而光合系统的功能没有明显变化；进一步研究表明，ELIP的功能是通过抑制叶绿素合成通路，来调节类囊体中叶绿素的含量[1]。
棉花（Gossypium spp.）是一種重要的经济作物，棉花叶片发育为棉纤维发育提供养分，对于棉纤维发育十分重要[5]。目前未见棉花中关于ELIP基因的报道，本研究分析了一个棉花中的ELIP基因，命名为GhELIP1，对其基因序列、进化关系进行初步分析，并对其在棉花叶片发育过程中的表达模式进行了探索，发现该基因随着叶片发育表达量逐渐升高。研究目的旨在为棉花中进一步阐明GhELIP1基因的功能奠定基础，为棉花生物技术和分子育种提供优异的基因资源。
1 材料与方法
1.1 GhELIP1序列的获得和生物信息学分析
由于棉花基因组数据已测序，预测的CDS序列也在NCBI中公布，因此从NCBI中下载GhELIP1的全长序列（登录号：XP_016715826.1）。根据NCBI中的ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测其氨基酸序列。利用NCBI中的保守结构域数据库（Conserved Domain Database，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）预测GhELIP1蛋白的保守结构。利用EBI的在线网址（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/）进行多重序列比对分析，利用MEGA6.0构建进化树[6]。
1.2 实验材料的种植
将棉花种子泡种24 h后，选取饱满出芽的种子种于人工气候室，光周期为16 h光照、8 h黑暗，昼/夜温度分别为30℃/25℃，待子叶展平后标记为0 d，之后每隔5 d取1次样，直到子叶完全变黄，这一过程共为40 d，总共取样8次。每次取样时选取长势一致的叶片至少10片，均匀混合后在液氮中速冻，然后保存于超低温冰箱（-80℃）待用。每次取样3个重复。
1.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
使用plus 植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取总RNA，经质量检测合格后，使用反转录试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]进行cDNA第一链的合成。利用Primer premier6.0设计qRT-PCR引物，引物设计的标准为：片段大小50～250 bp，退火温度 （60±2） ℃，引物长度20～22 bp，GC 含量45%～55%[5]。GhELIP1上游引物序列为TCAGTTCATGAGCTCGGATG，下游引物序列为TTCCGCCCTTTACATATTCG。以棉花ACTIN为内参基因（GenBank登录号： AY305726），上游引物序列为ATCCTCCGTCTTGACCTTG，下游引物序列為TGTCCGTCAGGCAACTCAT。使用SYBR? Premix Ex TaqTM [Tli RNaseH Plus，宝生物工程（大连）有限公司]进行qRT-PCR反应，采用2- ΔΔCt法分析数据[7]。 2 结果与分析
2.1 GhELIP1序列分析
从NCBI上获得该基因的全长序列，如图1所示，该基因全长582 bp，由起始密码子ATG开始，终止密码子TAG结束。其碱基组成相对均匀：A为141个（24.22%），T为149个（25.60%），C为128个（21.99%），G为164个（28.18%）。编码的蛋白全长193 aa，利用保守结构域数据库对该蛋白的保守结构域进行预测，发现该蛋白属于叶绿素a/b结合蛋白超家族（e_value为7.26e-8），从氨基酸第94位到186位是该家族蛋白结构上都具有的3个跨膜α螺旋（图2）。因此说明棉花GhELIP1与其他物种中ELIP蛋白一样，均属于叶绿素a/b结合蛋白超家族。
2.2 GhELIP1进化关系分析
通过在NR库中进行BLASTP的比对，发现陆地棉（G. hirsutum）、亚洲棉（G. arboretum）和雷蒙德氏棉（G. raimondii）中共含有5条ELIP蛋白，其中陆地棉中2条（XP_016715826.1和XP_016715301.1），雷蒙德氏棉中1条（XP_012487200.1），亚洲棉中2条（XP_017605022.1和KHG26201.1）。将5个棉花ELIP蛋白、除棉花外与GhELIP1最为同源的可可（Theobroma cacao）ELIP蛋白和拟南芥中已知的两个ELIP蛋白进行氨基酸多重序列比对，发现8个ELIP蛋白都含有叶绿素a/b结合蛋白超家族的保守域，在这一保守域内绝大多数的氨基酸都是一致的，5个棉花中的ELIP蛋白保守域外的氨基酸序列也相对保守（图2）。将这8条氨基酸序列构建进化树，结果表明：5条棉花中的ELIP蛋白亲缘关系最近，聚为一类；可可与棉花ELIP蛋白亲缘关系也较近，聚在一起；拟南芥2个ELIP蛋白聚在一起，与棉花ELIP蛋白的亲缘关系最远（图3）。
2.3 GhELIP1在棉花叶片发育过程中的表达过程分析
将叶片按照生长过程分成8个时期，其中第35天时叶片变为黄绿色，第40天时彻底变黄。利用qRT-PCR检测了GhELIP1基因在棉花叶片发育过程中的表达情况，如图4所示，该基因在30 d之前的叶片中表达量极低，到35 d时表达量显著升高，40 d继续升高。表明GhELIP1基因在衰老的叶片中上调表达，而在成熟叶片中表达量较低。
3 讨论
陆地棉是最重要的栽培棉，属于异源四倍体，亚洲棉和雷蒙德氏棉是陆地棉的祖先种，通过系统发育关系分析，5个棉属中ELIP蛋白聚在一起，本研究的GhELIP1与雷蒙德氏棉中XP_012487200.1的亲缘关系更近，表明GhELIP1可能来自于雷蒙德氏棉，而另一个陆地棉中的ELIP蛋白（XP_016715301.1）则与亚洲棉的2条ELIP蛋白（XP_017605022.1和KHG26201.1）聚在一起，表明XP_016715301.1来自于亚洲棉。通过雷蒙德氏棉基因组测序，发现棉花与可可基因组存在大量同源片段，二者的亲缘关系最近[8]，本研究发现5条棉花中的ELIP蛋白与可可ELIP蛋白（EOY05794.1）聚在一起，也证实了这一结论。
目前ELIP蛋白已经在多个物种中被鉴定，其主要功能集中在抗逆。从齿肋赤藓体内获得6条含有完整ORF的ELIP基因，筛选了2条对其表达模式进行分析，发现二者对盐胁迫、冷胁迫、紫外胁迫、蓝光和红光两种强光胁迫都有响应，表明这2个基因具有非生物胁迫抗性和光保护作用[9]。从怪柳中克隆到一个ELIP基因，转化到烟草后植株耐盐性显著增加[10]。也有研究表明ELIP基因参与果实的成熟，将西红柿从幼嫩果实到成熟分为7个时期，前4个时期西红柿为青绿色，果实逐渐增大，第4个时期达到最大，第5个时期开始西红柿明显变黄，第6个时期以后变红，第7个时期完全成熟，ELIP基因的表达在前4个时期较低，第5个时期表达量最高，第6、7个时期表达量比第5个时期有一定程度的下降，但依然维持在一定的表达水平[4]。本研究发现GhELIP1基因在棉花衰老叶片中上调表达，表明GhELIP1可能参与棉花叶片的衰老，TZVETKOVA-CHEVOLLEAU等研究表明拟南芥ELIP2蛋白能够抑制叶绿素合成通路中的每一个步骤[1]，由此推测棉花GhELIP1基因也具有相似的功能，在衰老叶片中大量表达后，抑制叶绿素的合成，从而叶片由绿转黄，逐渐走向衰老。
参考文献：
[1] TZVETKOVA-CHEVOLLEAU T， FRANCK F， ALAWADY A E， et al. The light stress-induced protein ELIP2 is a regulator of chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology， 2010，50（5）：795-809.
[2] 李先文，謝素霞，张苏锋，等.植物早期光诱导蛋白基因研究进展[J].植物生理学报，2011，47（6）：540-544.
[3] MEYER G， KLOPPSTECH K. A rapidly light-induced chloroplast protein with a high turnover coded for by pea nuclear DNA[J]. European Journal of Biochemistry， 2010， 138（1）：201-207.
[4] BRUNO A K， WETZEL C M. The early light-inducible protein （ELIP） gene is expressed during the chloroplast-to-chromoplast transition in ripening tomato fruit[J]. Journal of Experimental Botany， 2004， 55（408）：2541-2548.
[5] 黄娟，范术丽，宋美珍，等.棉花尿苷二磷酸糖基转移酶基因GhUGT85O1的克隆及其功能分析[J].农业生物技术学报，2015，23（6）：701-710.
[6] TAMURA K， STECHER G， PETERSON D， et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology & Evolution， 2013， 30（12）：2725-2729.
[7] LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） Method[J]. Methods， 2001， 25（4）：402-408.
[8] WANG K， WANG Z， LI F， et al. The draft genome of a diploid cotton Gossypium raimondii[J]. Nature Genetics， 2012， 44（10）：1098 - 1103.
[9] 周雅.齒肋赤藓早期光诱导蛋白基因ELIP的克隆及功能分析[D].北京：中国科学院大学，2015.
[10] 王丙锋.柽柳ELIP基因的克隆与抗逆性分析[D].哈尔滨：东北林业大学，2008.
（责任编辑：丁志祥）
关键词 棉花；GhELIP1基因；序列；表达
中图分类号：S562；Q786 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.25.009
知网出版网址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20170908.1510.018.html 网络出版时间：2017/9/8 15：10：57
绿色植物中，叶绿素和类胡萝卜素结合在光系统中各种相关蛋白上捕获光能量。叶绿素结合蛋白有2种类型，第一类只结合叶绿素a，第二类既结合叶绿素a也结合叶绿素b。其中，第二类的叶绿素结合蛋白即为核基因编码的色素结合的集光复合体蛋白（light-harvesting complex，LHC）[1]。LHC家族蛋白由30多种不同成员组成，早期光诱导蛋白（early light-induced proteins， ELIPs）就是其中一种[2]。
ELIP蛋白最初是在豌豆中鉴定到的，它在黄化豌豆苗去黄化的早期被诱导表达，在叶绿体发育完全后停止表达[3]。随着生物技术的发展，如今ELIP蛋白已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、杨树（Populus L.）、苜蓿（Medicago L.）、茶树（Camellia sinensis）等多种植物中被鉴定[2]。ELIP蛋白有3个跨膜的α螺旋，其中螺旋Ⅰ和Ⅲ高度相似，分别对应LHCⅠ和LHCⅡ的相应区域。ELIP蛋白中的保守残基对于叶绿素a结合在LHC复合体上非常重要，目前已发现ELIP蛋白至少可以结合在4种叶绿素a分子上。LHC和ELIP的主要区别在于，ELIP蛋白只在发育的质体膜或将成熟叶片暴露在强光照下时瞬时表达。在强光照胁迫和一些其他环境胁迫（如寒冷、干旱、高温等）下， ELIP也会被诱导表达。此外，果实成熟也会诱导ELIP蛋白的合成[1， 4]。拟南芥中ELIP2的组成型表达导致叶绿体中叶绿素含量降低，伴随着类囊体中光合系统数量的减少，而光合系统的功能没有明显变化；进一步研究表明，ELIP的功能是通过抑制叶绿素合成通路，来调节类囊体中叶绿素的含量[1]。
棉花（Gossypium spp.）是一種重要的经济作物，棉花叶片发育为棉纤维发育提供养分，对于棉纤维发育十分重要[5]。目前未见棉花中关于ELIP基因的报道，本研究分析了一个棉花中的ELIP基因，命名为GhELIP1，对其基因序列、进化关系进行初步分析，并对其在棉花叶片发育过程中的表达模式进行了探索，发现该基因随着叶片发育表达量逐渐升高。研究目的旨在为棉花中进一步阐明GhELIP1基因的功能奠定基础，为棉花生物技术和分子育种提供优异的基因资源。
1 材料与方法
1.1 GhELIP1序列的获得和生物信息学分析
由于棉花基因组数据已测序，预测的CDS序列也在NCBI中公布，因此从NCBI中下载GhELIP1的全长序列（登录号：XP_016715826.1）。根据NCBI中的ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测其氨基酸序列。利用NCBI中的保守结构域数据库（Conserved Domain Database，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）预测GhELIP1蛋白的保守结构。利用EBI的在线网址（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/）进行多重序列比对分析，利用MEGA6.0构建进化树[6]。
1.2 实验材料的种植
将棉花种子泡种24 h后，选取饱满出芽的种子种于人工气候室，光周期为16 h光照、8 h黑暗，昼/夜温度分别为30℃/25℃，待子叶展平后标记为0 d，之后每隔5 d取1次样，直到子叶完全变黄，这一过程共为40 d，总共取样8次。每次取样时选取长势一致的叶片至少10片，均匀混合后在液氮中速冻，然后保存于超低温冰箱（-80℃）待用。每次取样3个重复。
1.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
使用plus 植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取总RNA，经质量检测合格后，使用反转录试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]进行cDNA第一链的合成。利用Primer premier6.0设计qRT-PCR引物，引物设计的标准为：片段大小50～250 bp，退火温度 （60±2） ℃，引物长度20～22 bp，GC 含量45%～55%[5]。GhELIP1上游引物序列为TCAGTTCATGAGCTCGGATG，下游引物序列为TTCCGCCCTTTACATATTCG。以棉花ACTIN为内参基因（GenBank登录号： AY305726），上游引物序列为ATCCTCCGTCTTGACCTTG，下游引物序列為TGTCCGTCAGGCAACTCAT。使用SYBR? Premix Ex TaqTM [Tli RNaseH Plus，宝生物工程（大连）有限公司]进行qRT-PCR反应，采用2- ΔΔCt法分析数据[7]。 2 结果与分析
2.1 GhELIP1序列分析
从NCBI上获得该基因的全长序列，如图1所示，该基因全长582 bp，由起始密码子ATG开始，终止密码子TAG结束。其碱基组成相对均匀：A为141个（24.22%），T为149个（25.60%），C为128个（21.99%），G为164个（28.18%）。编码的蛋白全长193 aa，利用保守结构域数据库对该蛋白的保守结构域进行预测，发现该蛋白属于叶绿素a/b结合蛋白超家族（e_value为7.26e-8），从氨基酸第94位到186位是该家族蛋白结构上都具有的3个跨膜α螺旋（图2）。因此说明棉花GhELIP1与其他物种中ELIP蛋白一样，均属于叶绿素a/b结合蛋白超家族。
2.2 GhELIP1进化关系分析
通过在NR库中进行BLASTP的比对，发现陆地棉（G. hirsutum）、亚洲棉（G. arboretum）和雷蒙德氏棉（G. raimondii）中共含有5条ELIP蛋白，其中陆地棉中2条（XP_016715826.1和XP_016715301.1），雷蒙德氏棉中1条（XP_012487200.1），亚洲棉中2条（XP_017605022.1和KHG26201.1）。将5个棉花ELIP蛋白、除棉花外与GhELIP1最为同源的可可（Theobroma cacao）ELIP蛋白和拟南芥中已知的两个ELIP蛋白进行氨基酸多重序列比对，发现8个ELIP蛋白都含有叶绿素a/b结合蛋白超家族的保守域，在这一保守域内绝大多数的氨基酸都是一致的，5个棉花中的ELIP蛋白保守域外的氨基酸序列也相对保守（图2）。将这8条氨基酸序列构建进化树，结果表明：5条棉花中的ELIP蛋白亲缘关系最近，聚为一类；可可与棉花ELIP蛋白亲缘关系也较近，聚在一起；拟南芥2个ELIP蛋白聚在一起，与棉花ELIP蛋白的亲缘关系最远（图3）。
2.3 GhELIP1在棉花叶片发育过程中的表达过程分析
将叶片按照生长过程分成8个时期，其中第35天时叶片变为黄绿色，第40天时彻底变黄。利用qRT-PCR检测了GhELIP1基因在棉花叶片发育过程中的表达情况，如图4所示，该基因在30 d之前的叶片中表达量极低，到35 d时表达量显著升高，40 d继续升高。表明GhELIP1基因在衰老的叶片中上调表达，而在成熟叶片中表达量较低。
3 讨论
陆地棉是最重要的栽培棉，属于异源四倍体，亚洲棉和雷蒙德氏棉是陆地棉的祖先种，通过系统发育关系分析，5个棉属中ELIP蛋白聚在一起，本研究的GhELIP1与雷蒙德氏棉中XP_012487200.1的亲缘关系更近，表明GhELIP1可能来自于雷蒙德氏棉，而另一个陆地棉中的ELIP蛋白（XP_016715301.1）则与亚洲棉的2条ELIP蛋白（XP_017605022.1和KHG26201.1）聚在一起，表明XP_016715301.1来自于亚洲棉。通过雷蒙德氏棉基因组测序，发现棉花与可可基因组存在大量同源片段，二者的亲缘关系最近[8]，本研究发现5条棉花中的ELIP蛋白与可可ELIP蛋白（EOY05794.1）聚在一起，也证实了这一结论。
目前ELIP蛋白已经在多个物种中被鉴定，其主要功能集中在抗逆。从齿肋赤藓体内获得6条含有完整ORF的ELIP基因，筛选了2条对其表达模式进行分析，发现二者对盐胁迫、冷胁迫、紫外胁迫、蓝光和红光两种强光胁迫都有响应，表明这2个基因具有非生物胁迫抗性和光保护作用[9]。从怪柳中克隆到一个ELIP基因，转化到烟草后植株耐盐性显著增加[10]。也有研究表明ELIP基因参与果实的成熟，将西红柿从幼嫩果实到成熟分为7个时期，前4个时期西红柿为青绿色，果实逐渐增大，第4个时期达到最大，第5个时期开始西红柿明显变黄，第6个时期以后变红，第7个时期完全成熟，ELIP基因的表达在前4个时期较低，第5个时期表达量最高，第6、7个时期表达量比第5个时期有一定程度的下降，但依然维持在一定的表达水平[4]。本研究发现GhELIP1基因在棉花衰老叶片中上调表达，表明GhELIP1可能参与棉花叶片的衰老，TZVETKOVA-CHEVOLLEAU等研究表明拟南芥ELIP2蛋白能够抑制叶绿素合成通路中的每一个步骤[1]，由此推测棉花GhELIP1基因也具有相似的功能，在衰老叶片中大量表达后，抑制叶绿素的合成，从而叶片由绿转黄，逐渐走向衰老。
参考文献：
[1] TZVETKOVA-CHEVOLLEAU T， FRANCK F， ALAWADY A E， et al. The light stress-induced protein ELIP2 is a regulator of chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology， 2010，50（5）：795-809.
[2] 李先文，謝素霞，张苏锋，等.植物早期光诱导蛋白基因研究进展[J].植物生理学报，2011，47（6）：540-544.
[3] MEYER G， KLOPPSTECH K. A rapidly light-induced chloroplast protein with a high turnover coded for by pea nuclear DNA[J]. European Journal of Biochemistry， 2010， 138（1）：201-207.
[4] BRUNO A K， WETZEL C M. The early light-inducible protein （ELIP） gene is expressed during the chloroplast-to-chromoplast transition in ripening tomato fruit[J]. Journal of Experimental Botany， 2004， 55（408）：2541-2548.
[5] 黄娟，范术丽，宋美珍，等.棉花尿苷二磷酸糖基转移酶基因GhUGT85O1的克隆及其功能分析[J].农业生物技术学报，2015，23（6）：701-710.
[6] TAMURA K， STECHER G， PETERSON D， et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology & Evolution， 2013， 30（12）：2725-2729.
[7] LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） Method[J]. Methods， 2001， 25（4）：402-408.
[8] WANG K， WANG Z， LI F， et al. The draft genome of a diploid cotton Gossypium raimondii[J]. Nature Genetics， 2012， 44（10）：1098 - 1103.
[9] 周雅.齒肋赤藓早期光诱导蛋白基因ELIP的克隆及功能分析[D].北京：中国科学院大学，2015.
[10] 王丙锋.柽柳ELIP基因的克隆与抗逆性分析[D].哈尔滨：东北林业大学，2008.
（责任编辑：丁志祥）