HPLC法同时测定麻黄-桂枝药对水煎液中5种成分的含量

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  摘要:为了进一步完善麻黄-桂枝药对的质量评价方法,利用HPLC法,分别在2种波长条件下,同时测定麻黄-桂枝水煎液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5种成分的含量。采用Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温为35 ℃,波长分别为210,280 nm。结果表明,盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸和桂皮醛的进样量分别为0.292 6~2.926 0,0.205 6~2.056 0,0.016 2~0.162 0 ,0.021 8~0.218 0,0.052 6~0.526 0 μg时,均呈现出良好的线性关系(r≥0.999 1);平均加样回收率为96.24%~104.03%(RSD<3%,n=9)。建立的检测方法准确、可靠,可为麻黄-桂枝药对的质量控制及配伍研究提供参考。
  关键词:中药化学;高效液相色谱;波长切换;含量测定;麻黄;桂枝;药对
  中图分类号:R284.1文献标识码:ADOI: 10.7535/hbgykj.2021yx03005
  Abstract:In order to further improve the quality evaluation method of Ephedra-Cinnamomi Ramulus drug pair, the contents of ephedrine hydrochloride, pseudoephedrine hydrochloride, coumarin, cinnamic acid and cinnamaldehyde in the decoction of Ephedra-Cinnamomi Ramulus were determined by HPLC at two wavelengths. The analysis was carried out on a Diamonsil C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm) by gradient elution with acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was controlled at 35 ℃.The detection wavelength was 210 nm and 280 nm respectively. The results show that it has a good linearity in the ranges of 0.292 6~2.926 0, 0.205 6~2.056 0, 0.016 2~0.162 0, 0.021 8~0.218 0  and 0.052 6~0.526 0 μg for ephedrine hydrochloride, pseudoephedrine hydrochloride, coumarin, cinnamic acid and cinnamaldehyde, respectively (r≥0.999 1). The average recovery rates are 96.24%~104.03% (RSD<3%, n=9). The established detection method is accurate and reliable, which can provide reference for the quality control and compatibility research of Ephedra-Cinnamomi Ramulus drug pair.
  Keywords:chemistry of Chinese material medical; HPLC; wavelength switching; content determination; Ephedra; Cinnamomi Ramulus; drug pair
  麻黃-桂枝药对出自《伤寒论》麻黄汤,为辛温解表的常用组合[1]。麻黄味辛、微苦,性温,具有发汗散寒,宣肺平喘,利水消肿之功效;桂枝味辛、甘,性温,具有发汗解肌,温通经脉,助阳化气,平冲降气之功效[2]。麻黄善行肌表卫分,乃发汗之要药,桂枝透营达卫,助麻黄解表散邪,麻黄、桂枝相须为用[3-5]。麻黄的化学成分主要包括生物碱类、挥发油类等[6],桂枝主要含有挥发油类、有机酸类等[7-8]。查阅文献,对麻黄-桂枝药对的研究多集中在药理活性等方面[9-12],对其化学成分研究较少。徐文杰等[13]研究不同配伍配比对麻黄-桂枝药对有效成分含量的影响,分别采用GC-MS测定水煎液中麻黄类生物碱含量,采用HPLC测定水煎液中香豆素、桂皮醇、桂皮醛的含量。李晓如等[14]利用气相色谱-质谱对麻黄-桂枝的挥发油成分进行测定。目前未见HPLC法同时测定麻黄-桂枝水煎液中麻黄类生物碱和肉桂酸、桂皮醛等主要成分的报道。本实验建立HPLC法同时测定麻黄-桂枝药对水煎液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸和桂皮醛5种成分的含量,为麻黄-桂枝药对的质量控制及配伍的研究提供参考。第3期王迎春,等:HPLC法同时测定麻黄-桂枝药对水煎液中5种成分的含量河北工业科技第38卷
  1仪器与材料
  1.1仪器
  LC-15C高效液相色谱仪(SPD-15C型紫外检测器,日本岛津公司提供);TB-215D电子分析天平(十万分之一)、BSA224S-CW电子分析天平(万分之一)(德国赛多利斯集团提供);KQ-250E型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司提供)。
  1.2材料   盐酸麻黄碱(批号为171241-201508,纯度为99.8%)、盐酸伪麻黄碱(批号为171237-201510,纯度为99.8%)、肉桂酸(批号为110786-201604,纯度为98.8%),中国食品药品检定研究院提供;香豆素(批号为MUST-18040901,纯度为99.99%),成都曼思特生物科技有限公司提供;桂皮醛(批号为151119,纯度大于等于98.0%),成都普菲德生物技术有限公司提供。甲醇、乙腈(色谱纯),Fisher公司提供;磷酸(分析纯),天津市北方天医化学试剂厂提供;水为超纯水。实验所用中药饮片均为市售中药饮片,3批麻黄、桂枝饮片分别购自石家庄乐仁堂(麻黄批号为19111001,桂枝批号为20022101)、神威大药房(麻黄批号为19050101,桂枝批号为19031617)和新兴大药房(麻黄批号为2002121,桂枝批号为190902cp256),经河北省药品检验院孙宝惠(主任)鉴定,麻黄为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf.的干燥草质茎,桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥嫩枝。
  2方法与结果
  2.1麻黄-桂枝水煎液制备
  称取麻黄饮片12.0 g,桂枝饮片8.0 g,加10倍量水,麻黄浸泡30 min,先煎煮20 min,加入桂枝继续煎煮,煮沸后保持微沸30 min,过滤;药渣加8倍量水,煮沸后保持微沸20 min,过滤;合并2次滤液,定容至300 mL,得麻黄-桂枝水煎液。
  2.2溶液制备
  2.2.1对照品溶液
  分别精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛对照品适量,加甲醇制成质量浓度分别为1.219,0.514,1.017,0.546,0.526 mg/mL的单一对照品储备液。分别精密量取一定量的上述储备液,置于同一量瓶中,加甲醇制成每1 mL含盐酸麻黄碱146.3 μg、盐酸伪麻黄碱102.8 μg、香豆素8.1 μg、肉桂酸10.9 μg、桂皮醛28.4 μg的混合对照品溶液。
  2.2.2供试品溶液
  精密吸取2.1项中麻黄-桂枝水煎液4 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,超声处理(功率250 W,频率35 kHz)20 min,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
  2.3色譜条件
  色谱柱:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脱,梯度洗脱程序见表1,检测波长分别为210 nm(0~20 min)、280 nm(20~60 min),流速为1.0 mL/min,柱温为35 ℃,进样量为10 μL。混合对照品和供试品溶液的HPLC色谱图如图1所示。
  2.4方法学考察
  2.4.1线性关系考察
  分别精密吸取混合对照品溶液2,4,6,10,15,20 μL,按2.3项中色谱条件测定。以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标,进行线性回归,回归方程与线性范围结果见表2。
  2.4.2精密度试验
  精密吸取混合对照品溶液10 μL,按2.3项中色谱条件连续进样6次,计算各成分峰面积的RSD,依次为0.51%,0.63%,0.78%,0.52%,0.47%。结果表明仪器的精密度良好。
  2.4.3稳定性试验
  取同一份供试品溶液,分别在0,4,8,12,16,24 h按2.3项中色谱条件测定,计算各成分峰面积的RSD,依次为1.23%,0.82%,0.94%,0.59%,1.60%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
  2.4.4重复性试验
  取同一批麻黄-桂枝水煎液,按2.2.2制备6份供试品溶液,按2.3中色谱条件测定,计算各成分的平均质量浓度,分别为0.319 2,0.246 8,0.020 1,0.029 4,0.054 1 mg/mL,RSD分别为2.08%,1.75%,1.83%,1.68%,1.82%。结果表明该方法的重复性良好。
  2.4.5加样回收试验
  精密吸取已测得含量的麻黄-桂枝水煎液2.0 mL,平行吸取9份,分别精密加入等同于样品中各成分含有量50%,100%,150%的各单一对照品储备液,按照2.2.2项制备供试品溶液,按2.3项中色谱条件测定,计算加样回收率及RSD,结果见表3。
  2.5样品测定
  取3批次麻黄、桂枝饮片,按2.1项中制备麻黄-桂枝水煎液,按2.2.2项制备供试品溶液,按2.3项中色谱条件测定,平行3次,计算3批水煎液样品中各成分的含量,结果见表4。
  3讨论
  麻黄-桂枝为临床上常用的药对,是《伤寒论》中辛温发汗的常用组合。《伤寒论》中涉及麻黄-桂枝配伍的方剂有9方,分别是麻黄汤(3∶2)、葛根汤(3∶2)、葛根加半夏汤(3∶2)、大青龙汤(3∶1)、小青龙汤(1∶1)、桂枝二越婢一汤(1∶1)、桂枝麻黄各半汤(8∶13)、桂枝二麻黄一汤(5∶13)、麻黄升麻汤(10∶1),各方中麻黄-桂枝的配伍比例以3∶2居多[15]。本实验参考《伤寒论》中涉及麻黄-桂枝配伍方剂的煎煮方法,查阅相关文献[16-17],结合《医疗机构中药煎药室管理规范》要求,确定了2.1项中样品溶液制备方法。
  本实验分别考察了乙腈-1%醋酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸3种流动相系统,以各色谱峰的分离度和峰形为指标进行比较,结果发现乙腈-0.1%磷酸作为流动相梯度洗脱时,各色谱峰的分离度及峰形较好,故选择乙腈-0.1%磷酸为流动相。
  采用PDA检测器在200~400 nm进行紫外吸收光谱扫描,结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5种化学成分的最大吸收波长分别为205,205,276,276,288 nm,由此选择210 nm作为检测盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的波长,选择280 nm作为检测香豆素、肉桂酸、桂皮醛的波长。   4结语
  本实验通过切换波长,建立了HPLC法同时测定麻黄-桂枝药对水煎液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、香豆素、肉桂酸、桂皮醛5种化学成分含量的分析方法,共测定了3批麻黄-桂枝水煎液中上述5种成分的含量。结果显示,不同批次麻黄-桂枝水煎液中上述5种成分的含量波动较大,特别是盐酸伪麻黄碱和桂皮醛的含量。这可能与实验用的3批麻黄、桂枝的厂家、采收时间及存放时间不同有关。本实验所建立的方法操作简便,重复性好,可为麻黄-桂枝药对的质量控制与评价及后续研究提供参考。
  本实验仅对市售的3批不同厂家的麻黄和桂枝饮片按3∶2配比制备的水煎液进行了5种成分的含量测定,后续将会增加样本数目,分别测定麻黄、桂枝单煎液和麻黄-桂枝合煎液中主要成分的含量,考察麻黄、桂枝配伍前后各成分含量变化情况。不同配伍配比的麻黄-桂枝水煎液中各成分的含量变化规律及药效学考察有待进一步研究。
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