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摘要综述了小麦育种的创新研究进展,包括品种类型创新、资源创新、育种技术创新等,以期为小麦育种提供科学依据。
关键词小麦;育种创新;研究进展
中图分类号 S512.1 文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)21-0080-03
小麦是我国重要粮食作物,并且是作为储备粮的最好粮食品种,常年占国家储备粮的1/2以上。因此,通过小麦育种创新,培育和生产更多高产、稳产、优质的小麦品种对国家粮食安全和改善民生具有重要意义。提到小麦育种创新,很多人往往把转基因技术的应用(基因工程)作为重点。然而在20世纪的前20年,转基因技术在小麦品种的选育和商业化利用上还仅仅处于起步阶段。即使是转基因作物中起步早、成效最大的玉米、大豆等粮食作物,主要输入特性也仅限于农药效率改进型的(包括除草剂耐性的HT和抗虫性的Bt基因)技术进步,对作物产量的影响主要体现在减少虫害和杂草影响损失,对提高产量的作用有限。如美国农业部资料,美国全国的玉米平均单产2004—2008年比1991—1995年提高了28%,只有3%～4%归功于转基因Bt特性,而24%～25%仍归功于传统育种。因此,笔者认为小麦育种创新应从多方位进行探讨,包括品种类型的改进、资源创新和多途径的技术创新等,才能更快更好地促使育种创新在生产上发挥作用。
1品种类型的创新
近年玉米郑单958(种植面积连续多年占全国第1)和美国推广的先锋号等系列,都是由过去高株大穗型向耐密抗倒型改变,大大提高了丰产、稳产性。小麦矮化育种也是一例,随着机械化收割的普及,高产半矮秆仍是今后育种的重要方向[1]。河南省的兰考号系列以大穗大粒型连续多年在3 hm2以上面积获得10.5 t/hm2的高产也是一种新的探索,但由于其株间竞争和成穗率不足问题尚待进一步改善。除高产类型的多样化创新外,笔者认为类型的创新还应注意另外2种类型的创新。一是对水、肥利用率的高效利用问题。我国是水资源贫乏国家,随着工业化、城市化的发展,农业用水更受制约,因此培育旱地高产品种和水浇地水分利用率(WUE)高的品种都是今后应引起注意的类型。在肥料利用率上也是如此,已有研究资料表明在氮素利用率上不同品种间相差异可达70%。在低磷条件下,磷高效品种产量仅降低5%左右,而磷低效品种产量可降低40%左右,有关资料还显示,小麦根系分泌物对土壤中磷转化利用有重要作用。二是高效节能和环保问题。类型创新中还表现对多抗性品种的需求,除非生物逆境(如寒、旱、高温等)外,生物逆境(病、虫害等)的抗耐性品种间也有明显差异,而由于农药的使用,近年我国育成品种在抗性上有降低关注度的现象,而农药不仅污染环境且易致虫害耐药性的扩展。因此,高效节能和环保也是作物育种应注意的方向。
2资源创新
种质资源是育种的重要基础,没有野败的发现,就没有杂交水稻;没有太谷核不育基因的发现,就不可能进行小麦真正轮回选择。目前资源创新主要包括下列4种方式。
2.1远缘杂交
这是目前最有效的方法,国外1B/1R易位系已广泛应用,我国已选育的异缘染色体附加系(异代换系)至少有9类,其中见成效的包括小麦和黑麦、长穗偃麦草、天兰冰草、蔟毛麦和大赖草的异易位系,有的已用于育成品种如小偃号系列、兰考号系列、小冰麦等。此外,小麦与野燕麦杂交,据报导也有可能产生有用亲本,但机理未明。
2.2理化因素诱变
多为γ射线辐照,也有用γ射线与DES复合处理结合育成的,如南阳市农业科学研究所的宛原75-6已用作亲本育成新品种,近年还有人探索航天诱变、高能离子束诱变等。
2.3利用轮回选择或渐渗育种
如笔者曾用多个抗白粉基因源与农艺亲本组成轮选群选育出兼具Pm4、Pm8、Pm34等3个抗白粉主基因且农艺性状比较好的豫麦50在生产上应用,山东农业大学的矮孟牛结合了不同基因型的有利基因,矮败小麦也是把矮化与核不育基因结合的典型成功例子。
2.4转基因技术的应用
目前主要应用基因枪法转化幼胚愈伤组织导入一些抗病、虫害和优质基因,还有报道在高光效有关酶和淀粉合成酶的转化获可遗传材料,但由于目前转基因技术的应用还受基因型的限制,只能用敏感的基因型先转化成含有用基因的亲本,再通过杂交回交育成品种。在转基因技术中还有利用花粉管通道法导入外缘DNA的,但是否能导入有用基因往往是随机性的,作者曾利用由大麦DNA导入的抗白粉材料作亲本,与高产感病品种进行杂交和加代回交,获得抗病材料而其他农艺性状变化不大,说明此类方法有可能导入可遗传的有利基因。
3育种技术的改进创新
3.1轮回选择
基因重组和选择是育种工作的重要内容,轮回选择能较好地兼顾这二者,在抗逆育种中利用在逆境下进行轮回选择,使自然选择与人工选择结合起来是其特殊优越之处,典型实例如在盐碱地上轮选育成的轮抗7号在含盐量0.4%的盐池中能正常生长,1988年在河北干旱盐碱地上(全盐量0.27%)获4 500 kg/hm2的产量,较当地推广种增产10%～15%。中国农业科学院利用矮败轮选育成的轮选987在北方冬麦区试中产量位居第1,已在北京、河北等地推广。山东省还通过矮败轮选获得几个具超高产潜力品系。今后如与分子标记等技术结合,在培育高产、抗逆、优质品种上将可获得更大进展。
3.2远缘杂交与诱变育种
越来越多的诱变手段把远缘杂交与诱变育种结合起来应用也是一种方式,理论上有可能有利于基因重组或易位,小偃6号可能就是二者结合的产物,虽然其机理尚待深入探讨。另外,笔者根据有关报导和育种材料的观察,发现远缘花粉的导入不一定是异种属基因的直接作用,而有可能在其刺激作用下激活了原小麦品种自身处于沉默状态的转座子和反转录座子,因而促进沉默基因表达,或者改变某些基因DNA高度重复序列的拷贝数,引起等位基因的变异,因而产生了抗病性、矮化以至优质等位基因的变化,是值得进一步探索的问题。
3.3杂种优势的利用与固定
杂种优势在产量上表现已被多数研究者肯定,还看到在品质上(如面包体积)存在杂种优势,另外有的品种具有单基因抗性并在F1代表现为显性,因此对高产感病品种也有应用价值。目前存在的主要问题是小麦繁殖系数低而用种量大,用种成本较高,如能开发出高效价廉的化学去雄剂则有利用前途。也有人探索杂种优势的固定,小麦利用含不同血缘兼性无融合生殖系杂交以产生固定优势的后代已有初步报导,不过已有无融合生殖系农艺性状尚不理想,因此对其进行遗传改良以培育含不同理想性状的无融合生殖系,产生更大杂种优势的不分离类型还有待进一步探索。不论何种方式利用杂种优势,因F1株高优势强,故亲本均需选用较矮材料(旱地利用者可放宽些)。
3.4细胞工程育种
包括花药培养、原生质体培养、体细胞杂交及体细胞无性系变异等。目前取得较多成效的是花药培养然后加倍成纯合二倍体,可减少分离世代,缩短育种年限,已获得一批在生产上推广的品种。其主要问题是幼苗诱导率低(5%左右),H2群体多的也只在50个左右,与常规育种F2的上千个分离材料相比,选出优异材料概率明显偏低。另外,基因型对培养基的敏感性问题导致只有少数基因型可以利用,今后宜从改进培养方法提高幼苗诱导频率和利用易培养基因型与优异品种杂交提高不同基因型的利用。除了花药培养外,近年也探索了其他单倍体加倍途径,如利用玉米、小黑麦等花粉授于去雄品种进行单倍体诱导(染色体消失法),然后通过胚培养分化单倍体幼苗,有的可直接自然加倍,此法不受基因型限制且幼苗诱导频率较高,可予关注。在花药培养过程中还可以通过改变培养条件,添加诱变剂或特殊筛选材料(如高渗透液、某些病害毒素等)诱变和筛选配子体无性系变异材料。此外,利用花药培养构建合适的DH群体,对筛选有用分子标记也有重要意义。
3.5基因工程
这是有目的转化有用基因的最有发展前景的技术。其内容包括目的基因的分离、纯化和体外重组、遗传转化(将目的基因引入受体并进行转化体的选择与植株再生)、转化植株的鉴定与利用。据报道小麦方面目前国内外已有近200例。采用的方法有基因枪法、农杆菌介导和花粉管通道法等。包括抗除草剂、抗病虫、改良品质、抗旱耐盐等基因。但真正能稳定表达并遗传下来应用于品种改良的却极少。国内报导的较有应用意义的有转化优质高分子谷蛋白基因[2]、抗病毒、抗蚜、高光效相关酶、抗穗发芽、抗真菌病害等方面的材料。
目前存在的问题:一是有实际应用价值的目的基因分离、克隆难度还较大,特别是小麦基因数目庞大,许多性状受多基因控制,今后可通过比较基因组学与生物信息学技术的发展,加强小麦遗传图谱的补充等手段,挖掘新基因满足基因克隆的要求。国内还有利用反义基因操作的报导。二是改进载体系统和有效的转化方法。现有转化方法主要以基因枪的直接转化法为主,占转基因报导的60%以上。该方法存在的问题是诱导产生转化植株需利用幼胚、幼穗等外植体通过胚培养获得,而胚培养往往受基因型的限制,其次基因枪转化法外源基因的整合往往多拷贝多位点,易导致遗传表达的不稳定。利用对胚培养敏感的基因型导入外源基因,再转入到优良农艺性状品种并回交可能部分解决这一问题,扩大To群体也可有可能使多拷贝的外源有功能基因能整合在同一位点上。农杆菌介导外源基因整合位点单一,遗传较稳定但也存在基因型敏感性问题,不同基因型不同外植体对农杆菌介导反应不同[3],现已发现一些优质或农艺性状好的基因型有较好的敏感性,培养方式也有一定作用。基于“DNA片段杂交理论”的花粉管通道法导入外源DNA在国内报导较多,但一般是用外缘植物DNA一段,缺乏明确的标的基因,不过此法较易进行,在转入抗性上较明显。三是目的基因在受体中的表达还不够理想。这个问题较为复杂,包括缺乏高效表达的理想启动子,有些启动子还希望能在一定时空下发挥作用。DNA甲基化以及共抑制、基因上位性等原因也可导致不表达或表达不稳定,受体的遗传背景也很重要。另外,目前主要转化方法往往使基因在受体染色体上插入与整合随机发生,转化后代有可能在后代分离过程中丢失或由于组织培养环节产生无性系变异。除上述问题外,目前转化的主要是单基因控制性状,对产量等多基因控制性状调控体系复杂,其转基因工作还有待较长时间的探索。在与育种结合方面目前也作了一些有益的探索,例如在抗病育种中,用不同来源双价目的基因导入以提高抗病性,还有利用防御素有关基因以及抗病信号途径中的信号传导基因培育广谱抗病小麦株系的报导,都是值得进一步研究的途径。四是转基因材料的副作用。现有研究已发现有的转化材料转入某一有利性状基因时同时也会发生株高、产量向不利方向变化的现象,机理尚待进一步研究。还有一个比较突出的问题是筛选标记基因如抗除草剂、抗生素等选择标记基因存在转基因植物中,目前已有利用基因工程技术剔除标记基因的方法如共转化[4]、转座子、位点专一性重组等。至于食物安全性评价更是一个争论的问题,例如抗虫的外源凝集素具抗营养因子,至于致敏、致病的问题更有待长期观察,笔者认为从现有食用植物中提取的基因可能有害性会少些。其他引起关注的还有生态环境的影响。
3.6分子标记辅助育种
分子标记由于能对育种材料不同发育时期的个体、组织进行检测,且不受环境影响,分子水平的遗传多态性表现为DNA核苷酸序列的差异,故检测手段更直接,其技术迅猛发展。近30年广泛用于基因定位、基因克隆及分子辅助育种[5-6]。
早期应用较多的是基于分子杂交的限制性片段长度多态性标记(RFLP),国内在小麦这方面研究较多,但因需要DNA量大且需设备多,技术复杂,难用于育种。随着PCR技术的应用,RAPD标记(随机扩增多态性DNA)因其所需DNA量少且设备简单而受关注,但此法稳定性差,难以重复而受限制,在此基础开发的SCAR标记(特异序列扩增区域标记)稳定性好,重复性强,国内已有人应用于小麦。目前效率最高的是AFLP标(扩增片段长度多态性),结合了RFLP与PCR优点,所需DNA量也不大,不足之处是成本高,需使用同位素或荧光素标记引物。目前在小麦应用上有前景的为STS标记(序列标签位点),由RFLP标记转化而来,其优势可从有关数据库(国际上通用)调出有关信息而设计引物,稳定性和重复性都很好,存在问题是现有RFLP探针多来源于小麦近源种属,有的与小麦基因组同源性较低,增加转化难度,国内已有人应用于小麦,如中国农业大学曾利用STS引物筛选出Rh1(抑制部分同源染色体配对)基因的连锁标记,并将它转换为SCAR标记在京411中筛选出Rh1b中间代换系。今后随STS标记的发展,有可能得到较快发展,国内在小麦应用的尚有SSR标记(微卫星DNA或简单序列重复标记),其优点是多态性频率高,亦广泛用于遗传图谱构建。
目前在小麦应用的还有新型分子标记SNP和ESTs,SNP(单核苷酸多态性标记)数目多,覆盖密度大,由于可利用DNA芯片和微测序等方法检测,随着DNA芯片技术的发展,将成为重要的分子标记技术。ESTs(表达序列标记)优点在于直接与一个表达基因相关,且可通过genbank数据库中获得有用信息,国际上小麦已开发,登记的EST已达数十万条。研究表明,7%～10%的EST序列存在简单重复序列,因此还可从EST序列中开发利用新的SSR引物,国际上还有人从EST中开发SNP引物[7],EST-SSR不足之处是多态性低于来自基因组的SSR,但EST-SSRs含量丰富,可通过EST数据库搜索开发,无需建库测序,故开发成本低,效率高。
分子标记近30年虽有了很大发展,但就小麦而言,在小麦遗传图谱中的密度远不够饱和,不能满足育种的需要,亟需研制和采用新的分子标记,填补遗传图谱中的大缝隙,特别是重要与育种目标有关的分子标记。标记不是基因,由于重组可使标记与基因分离,导致选择偏离方向。现在报导的许多标记往往与目的基因连锁不够紧密,一个基因可有5～6个甚至更多标记,因此可能出现假阳性[8]。此外,上位性的存在等原因,不同遗传背景中的基因型可导致亲本间多态性的消失,发展饱和遗传图谱,寻找与目的基因连锁的两侧标记,可能是解决途径之一。可以考虑同时用互不干扰的标记筛选多个与目标改善有关的基因,例如安徽省农业科学院曾用多重PCR体系同时标记筛选和多个优质谷蛋白基因等有关品质性状基因。今后分子标记辅助育种应重点放在重要目标性状有关的标记,因为分子标记技术较复杂和费用较高,一些能用其他方法(例如生化标记上利用电泳,现在已可以分析很多有关品质性状的基因型)可以解决的没有必要用分子标记。
4参考文献
[1] 林作楫,许为钢,刘文轩.小麦遗传育种工程技术[M]//吴景锋.作物遗传育种工程.郑州:河南科学技术出版社,2000:63-113.
[2] 耿惠敏,李勇慧,刘雪琴,等.小麦远缘杂交后代高分子量谷蛋白亚基变异机制探讨[J].河南农业科学,2010(6):9-12.
[3] 王艳丽,叶兴国,刘艳鹏,等.农杆菌敏感小麦基因型的筛选研究[J].麦类作物学报,2005,25(6):6-10.
[4] 张新梅,徐惠君,杜丽璞,等.共转化法剔除转基因小麦中的bar基因[J].作物学报,2004,30(1):26-30.
[5] 胡琳.小麦分子标记技术研究进展[M]//王绍中.河南小麦育种栽培研究进程.北京:中国农业科学技术出版社,2007:116-123.
[6] 沈新莲,张天真.作物分子标记辅助选择育种研究的进展与展望[J].高技术通讯,2003,13(2):105-110.
[7] 陈军方,任正隆,高丽锋,等.从小麦EST序列中开发新的SSR引物[J].作物学报,2005,31(2):154-158.
[8] 万映秀,张晓科,夏先春,等.多重PCR的建立及黄淮麦区主要品种品质相关基因的鉴定[J].中国农业科学,2008,41(3):643-653.
关键词小麦;育种创新;研究进展
中图分类号 S512.1 文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)21-0080-03
小麦是我国重要粮食作物,并且是作为储备粮的最好粮食品种,常年占国家储备粮的1/2以上。因此,通过小麦育种创新,培育和生产更多高产、稳产、优质的小麦品种对国家粮食安全和改善民生具有重要意义。提到小麦育种创新,很多人往往把转基因技术的应用(基因工程)作为重点。然而在20世纪的前20年,转基因技术在小麦品种的选育和商业化利用上还仅仅处于起步阶段。即使是转基因作物中起步早、成效最大的玉米、大豆等粮食作物,主要输入特性也仅限于农药效率改进型的(包括除草剂耐性的HT和抗虫性的Bt基因)技术进步,对作物产量的影响主要体现在减少虫害和杂草影响损失,对提高产量的作用有限。如美国农业部资料,美国全国的玉米平均单产2004—2008年比1991—1995年提高了28%,只有3%～4%归功于转基因Bt特性,而24%～25%仍归功于传统育种。因此,笔者认为小麦育种创新应从多方位进行探讨,包括品种类型的改进、资源创新和多途径的技术创新等,才能更快更好地促使育种创新在生产上发挥作用。
1品种类型的创新
近年玉米郑单958(种植面积连续多年占全国第1)和美国推广的先锋号等系列,都是由过去高株大穗型向耐密抗倒型改变,大大提高了丰产、稳产性。小麦矮化育种也是一例,随着机械化收割的普及,高产半矮秆仍是今后育种的重要方向[1]。河南省的兰考号系列以大穗大粒型连续多年在3 hm2以上面积获得10.5 t/hm2的高产也是一种新的探索,但由于其株间竞争和成穗率不足问题尚待进一步改善。除高产类型的多样化创新外,笔者认为类型的创新还应注意另外2种类型的创新。一是对水、肥利用率的高效利用问题。我国是水资源贫乏国家,随着工业化、城市化的发展,农业用水更受制约,因此培育旱地高产品种和水浇地水分利用率(WUE)高的品种都是今后应引起注意的类型。在肥料利用率上也是如此,已有研究资料表明在氮素利用率上不同品种间相差异可达70%。在低磷条件下,磷高效品种产量仅降低5%左右,而磷低效品种产量可降低40%左右,有关资料还显示,小麦根系分泌物对土壤中磷转化利用有重要作用。二是高效节能和环保问题。类型创新中还表现对多抗性品种的需求,除非生物逆境(如寒、旱、高温等)外,生物逆境(病、虫害等)的抗耐性品种间也有明显差异,而由于农药的使用,近年我国育成品种在抗性上有降低关注度的现象,而农药不仅污染环境且易致虫害耐药性的扩展。因此,高效节能和环保也是作物育种应注意的方向。
2资源创新
种质资源是育种的重要基础,没有野败的发现,就没有杂交水稻;没有太谷核不育基因的发现,就不可能进行小麦真正轮回选择。目前资源创新主要包括下列4种方式。
2.1远缘杂交
这是目前最有效的方法,国外1B/1R易位系已广泛应用,我国已选育的异缘染色体附加系(异代换系)至少有9类,其中见成效的包括小麦和黑麦、长穗偃麦草、天兰冰草、蔟毛麦和大赖草的异易位系,有的已用于育成品种如小偃号系列、兰考号系列、小冰麦等。此外,小麦与野燕麦杂交,据报导也有可能产生有用亲本,但机理未明。
2.2理化因素诱变
多为γ射线辐照,也有用γ射线与DES复合处理结合育成的,如南阳市农业科学研究所的宛原75-6已用作亲本育成新品种,近年还有人探索航天诱变、高能离子束诱变等。
2.3利用轮回选择或渐渗育种
如笔者曾用多个抗白粉基因源与农艺亲本组成轮选群选育出兼具Pm4、Pm8、Pm34等3个抗白粉主基因且农艺性状比较好的豫麦50在生产上应用,山东农业大学的矮孟牛结合了不同基因型的有利基因,矮败小麦也是把矮化与核不育基因结合的典型成功例子。
2.4转基因技术的应用
目前主要应用基因枪法转化幼胚愈伤组织导入一些抗病、虫害和优质基因,还有报道在高光效有关酶和淀粉合成酶的转化获可遗传材料,但由于目前转基因技术的应用还受基因型的限制,只能用敏感的基因型先转化成含有用基因的亲本,再通过杂交回交育成品种。在转基因技术中还有利用花粉管通道法导入外缘DNA的,但是否能导入有用基因往往是随机性的,作者曾利用由大麦DNA导入的抗白粉材料作亲本,与高产感病品种进行杂交和加代回交,获得抗病材料而其他农艺性状变化不大,说明此类方法有可能导入可遗传的有利基因。
3育种技术的改进创新
3.1轮回选择
基因重组和选择是育种工作的重要内容,轮回选择能较好地兼顾这二者,在抗逆育种中利用在逆境下进行轮回选择,使自然选择与人工选择结合起来是其特殊优越之处,典型实例如在盐碱地上轮选育成的轮抗7号在含盐量0.4%的盐池中能正常生长,1988年在河北干旱盐碱地上(全盐量0.27%)获4 500 kg/hm2的产量,较当地推广种增产10%～15%。中国农业科学院利用矮败轮选育成的轮选987在北方冬麦区试中产量位居第1,已在北京、河北等地推广。山东省还通过矮败轮选获得几个具超高产潜力品系。今后如与分子标记等技术结合,在培育高产、抗逆、优质品种上将可获得更大进展。
3.2远缘杂交与诱变育种
越来越多的诱变手段把远缘杂交与诱变育种结合起来应用也是一种方式,理论上有可能有利于基因重组或易位,小偃6号可能就是二者结合的产物,虽然其机理尚待深入探讨。另外,笔者根据有关报导和育种材料的观察,发现远缘花粉的导入不一定是异种属基因的直接作用,而有可能在其刺激作用下激活了原小麦品种自身处于沉默状态的转座子和反转录座子,因而促进沉默基因表达,或者改变某些基因DNA高度重复序列的拷贝数,引起等位基因的变异,因而产生了抗病性、矮化以至优质等位基因的变化,是值得进一步探索的问题。
3.3杂种优势的利用与固定
杂种优势在产量上表现已被多数研究者肯定,还看到在品质上(如面包体积)存在杂种优势,另外有的品种具有单基因抗性并在F1代表现为显性,因此对高产感病品种也有应用价值。目前存在的主要问题是小麦繁殖系数低而用种量大,用种成本较高,如能开发出高效价廉的化学去雄剂则有利用前途。也有人探索杂种优势的固定,小麦利用含不同血缘兼性无融合生殖系杂交以产生固定优势的后代已有初步报导,不过已有无融合生殖系农艺性状尚不理想,因此对其进行遗传改良以培育含不同理想性状的无融合生殖系,产生更大杂种优势的不分离类型还有待进一步探索。不论何种方式利用杂种优势,因F1株高优势强,故亲本均需选用较矮材料(旱地利用者可放宽些)。
3.4细胞工程育种
包括花药培养、原生质体培养、体细胞杂交及体细胞无性系变异等。目前取得较多成效的是花药培养然后加倍成纯合二倍体,可减少分离世代,缩短育种年限,已获得一批在生产上推广的品种。其主要问题是幼苗诱导率低(5%左右),H2群体多的也只在50个左右,与常规育种F2的上千个分离材料相比,选出优异材料概率明显偏低。另外,基因型对培养基的敏感性问题导致只有少数基因型可以利用,今后宜从改进培养方法提高幼苗诱导频率和利用易培养基因型与优异品种杂交提高不同基因型的利用。除了花药培养外,近年也探索了其他单倍体加倍途径,如利用玉米、小黑麦等花粉授于去雄品种进行单倍体诱导(染色体消失法),然后通过胚培养分化单倍体幼苗,有的可直接自然加倍,此法不受基因型限制且幼苗诱导频率较高,可予关注。在花药培养过程中还可以通过改变培养条件,添加诱变剂或特殊筛选材料(如高渗透液、某些病害毒素等)诱变和筛选配子体无性系变异材料。此外,利用花药培养构建合适的DH群体,对筛选有用分子标记也有重要意义。
3.5基因工程
这是有目的转化有用基因的最有发展前景的技术。其内容包括目的基因的分离、纯化和体外重组、遗传转化(将目的基因引入受体并进行转化体的选择与植株再生)、转化植株的鉴定与利用。据报道小麦方面目前国内外已有近200例。采用的方法有基因枪法、农杆菌介导和花粉管通道法等。包括抗除草剂、抗病虫、改良品质、抗旱耐盐等基因。但真正能稳定表达并遗传下来应用于品种改良的却极少。国内报导的较有应用意义的有转化优质高分子谷蛋白基因[2]、抗病毒、抗蚜、高光效相关酶、抗穗发芽、抗真菌病害等方面的材料。
目前存在的问题:一是有实际应用价值的目的基因分离、克隆难度还较大,特别是小麦基因数目庞大,许多性状受多基因控制,今后可通过比较基因组学与生物信息学技术的发展,加强小麦遗传图谱的补充等手段,挖掘新基因满足基因克隆的要求。国内还有利用反义基因操作的报导。二是改进载体系统和有效的转化方法。现有转化方法主要以基因枪的直接转化法为主,占转基因报导的60%以上。该方法存在的问题是诱导产生转化植株需利用幼胚、幼穗等外植体通过胚培养获得,而胚培养往往受基因型的限制,其次基因枪转化法外源基因的整合往往多拷贝多位点,易导致遗传表达的不稳定。利用对胚培养敏感的基因型导入外源基因,再转入到优良农艺性状品种并回交可能部分解决这一问题,扩大To群体也可有可能使多拷贝的外源有功能基因能整合在同一位点上。农杆菌介导外源基因整合位点单一,遗传较稳定但也存在基因型敏感性问题,不同基因型不同外植体对农杆菌介导反应不同[3],现已发现一些优质或农艺性状好的基因型有较好的敏感性,培养方式也有一定作用。基于“DNA片段杂交理论”的花粉管通道法导入外源DNA在国内报导较多,但一般是用外缘植物DNA一段,缺乏明确的标的基因,不过此法较易进行,在转入抗性上较明显。三是目的基因在受体中的表达还不够理想。这个问题较为复杂,包括缺乏高效表达的理想启动子,有些启动子还希望能在一定时空下发挥作用。DNA甲基化以及共抑制、基因上位性等原因也可导致不表达或表达不稳定,受体的遗传背景也很重要。另外,目前主要转化方法往往使基因在受体染色体上插入与整合随机发生,转化后代有可能在后代分离过程中丢失或由于组织培养环节产生无性系变异。除上述问题外,目前转化的主要是单基因控制性状,对产量等多基因控制性状调控体系复杂,其转基因工作还有待较长时间的探索。在与育种结合方面目前也作了一些有益的探索,例如在抗病育种中,用不同来源双价目的基因导入以提高抗病性,还有利用防御素有关基因以及抗病信号途径中的信号传导基因培育广谱抗病小麦株系的报导,都是值得进一步研究的途径。四是转基因材料的副作用。现有研究已发现有的转化材料转入某一有利性状基因时同时也会发生株高、产量向不利方向变化的现象,机理尚待进一步研究。还有一个比较突出的问题是筛选标记基因如抗除草剂、抗生素等选择标记基因存在转基因植物中,目前已有利用基因工程技术剔除标记基因的方法如共转化[4]、转座子、位点专一性重组等。至于食物安全性评价更是一个争论的问题,例如抗虫的外源凝集素具抗营养因子,至于致敏、致病的问题更有待长期观察,笔者认为从现有食用植物中提取的基因可能有害性会少些。其他引起关注的还有生态环境的影响。
3.6分子标记辅助育种
分子标记由于能对育种材料不同发育时期的个体、组织进行检测,且不受环境影响,分子水平的遗传多态性表现为DNA核苷酸序列的差异,故检测手段更直接,其技术迅猛发展。近30年广泛用于基因定位、基因克隆及分子辅助育种[5-6]。
早期应用较多的是基于分子杂交的限制性片段长度多态性标记(RFLP),国内在小麦这方面研究较多,但因需要DNA量大且需设备多,技术复杂,难用于育种。随着PCR技术的应用,RAPD标记(随机扩增多态性DNA)因其所需DNA量少且设备简单而受关注,但此法稳定性差,难以重复而受限制,在此基础开发的SCAR标记(特异序列扩增区域标记)稳定性好,重复性强,国内已有人应用于小麦。目前效率最高的是AFLP标(扩增片段长度多态性),结合了RFLP与PCR优点,所需DNA量也不大,不足之处是成本高,需使用同位素或荧光素标记引物。目前在小麦应用上有前景的为STS标记(序列标签位点),由RFLP标记转化而来,其优势可从有关数据库(国际上通用)调出有关信息而设计引物,稳定性和重复性都很好,存在问题是现有RFLP探针多来源于小麦近源种属,有的与小麦基因组同源性较低,增加转化难度,国内已有人应用于小麦,如中国农业大学曾利用STS引物筛选出Rh1(抑制部分同源染色体配对)基因的连锁标记,并将它转换为SCAR标记在京411中筛选出Rh1b中间代换系。今后随STS标记的发展,有可能得到较快发展,国内在小麦应用的尚有SSR标记(微卫星DNA或简单序列重复标记),其优点是多态性频率高,亦广泛用于遗传图谱构建。
目前在小麦应用的还有新型分子标记SNP和ESTs,SNP(单核苷酸多态性标记)数目多,覆盖密度大,由于可利用DNA芯片和微测序等方法检测,随着DNA芯片技术的发展,将成为重要的分子标记技术。ESTs(表达序列标记)优点在于直接与一个表达基因相关,且可通过genbank数据库中获得有用信息,国际上小麦已开发,登记的EST已达数十万条。研究表明,7%～10%的EST序列存在简单重复序列,因此还可从EST序列中开发利用新的SSR引物,国际上还有人从EST中开发SNP引物[7],EST-SSR不足之处是多态性低于来自基因组的SSR,但EST-SSRs含量丰富,可通过EST数据库搜索开发,无需建库测序,故开发成本低,效率高。
分子标记近30年虽有了很大发展,但就小麦而言,在小麦遗传图谱中的密度远不够饱和,不能满足育种的需要,亟需研制和采用新的分子标记,填补遗传图谱中的大缝隙,特别是重要与育种目标有关的分子标记。标记不是基因,由于重组可使标记与基因分离,导致选择偏离方向。现在报导的许多标记往往与目的基因连锁不够紧密,一个基因可有5～6个甚至更多标记,因此可能出现假阳性[8]。此外,上位性的存在等原因,不同遗传背景中的基因型可导致亲本间多态性的消失,发展饱和遗传图谱,寻找与目的基因连锁的两侧标记,可能是解决途径之一。可以考虑同时用互不干扰的标记筛选多个与目标改善有关的基因,例如安徽省农业科学院曾用多重PCR体系同时标记筛选和多个优质谷蛋白基因等有关品质性状基因。今后分子标记辅助育种应重点放在重要目标性状有关的标记,因为分子标记技术较复杂和费用较高,一些能用其他方法(例如生化标记上利用电泳,现在已可以分析很多有关品质性状的基因型)可以解决的没有必要用分子标记。
4参考文献
[1] 林作楫,许为钢,刘文轩.小麦遗传育种工程技术[M]//吴景锋.作物遗传育种工程.郑州:河南科学技术出版社,2000:63-113.
[2] 耿惠敏,李勇慧,刘雪琴,等.小麦远缘杂交后代高分子量谷蛋白亚基变异机制探讨[J].河南农业科学,2010(6):9-12.
[3] 王艳丽,叶兴国,刘艳鹏,等.农杆菌敏感小麦基因型的筛选研究[J].麦类作物学报,2005,25(6):6-10.
[4] 张新梅,徐惠君,杜丽璞,等.共转化法剔除转基因小麦中的bar基因[J].作物学报,2004,30(1):26-30.
[5] 胡琳.小麦分子标记技术研究进展[M]//王绍中.河南小麦育种栽培研究进程.北京:中国农业科学技术出版社,2007:116-123.
[6] 沈新莲,张天真.作物分子标记辅助选择育种研究的进展与展望[J].高技术通讯,2003,13(2):105-110.
[7] 陈军方,任正隆,高丽锋,等.从小麦EST序列中开发新的SSR引物[J].作物学报,2005,31(2):154-158.
[8] 万映秀,张晓科,夏先春,等.多重PCR的建立及黄淮麦区主要品种品质相关基因的鉴定[J].中国农业科学,2008,41(3):643-653.