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doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.20.006
材料与方法
实验材料:①实验药物:胸腺肽α1(Tα1),受试药物,1.5mg/支,试验时用生理盐水分别配成002mg/ml、004mg/ml、008mg/ml低、中、高三个浓度,分装三个青霉素小瓶中备用。病毒唑(利巴韦林注射液),阳性对照药物,含量为100mg/ml。试验时用生理盐水配成13mg/ml浓度的药液。病毒株为流感病毒鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1),本实验室保存。在MDCK细胞中的组织半数感染量(TCID50)为10-4。细胞为狗肾细胞(MDCK),本实验室保存。②实验动物:健康昆明小鼠,雌雄各半,3～4周龄,体重18～20g,雌雄分别分组,由实验动物中心提供。合格证号:SCXK(吉)2003-0001。③实验试剂及用品:IMDM、小牛血清、青霉素、链霉素、培养瓶、细胞培养板、胰蛋白酶、EDTA、PBS(磷酸盐缓冲液)、MTT(四甲基偶氮唑盐)、DMSO(二甲基亚砜)。④实验仪器:CO2孵育箱、超净工作台、倒置显微镜、台式离心机、干燥箱、电冰箱、-80℃超低温冰箱、电热恒温培养箱、自动酶标仪。
实验方法:①细胞复苏、传代及冻存:细胞复苏,从液氮罐中取出冻存的MDCK细胞,迅速投入37℃水浴,融化后2000转/分,离心5分钟,弃上清,加少许IMDM培养液,反复吹打后加入到含有5ml培养液的培养瓶中,低倍镜下观察细胞悬浮情况,37℃ 5% CO2的培养箱中培养。细胞传代为待细胞贴壁长满,弃细胞培养液,以7:1的比例加入002%EDTA和025%胰酶消化,最好置CO2培养箱5～10分钟,可通过显微镜观察细胞收缩情況,待细胞完全收缩变圆后,停止消化,弃去消化液,加入IMDM生长液,反复吹打分散细胞,加入细胞培养液按1:3比例传代。细胞冻存,细胞长满瓶后一般在冻存前一天换液,用EDTA和胰酶消化至镜下细胞变圆,细胞之间距离变大,用无菌吸管将其吸至一个过酸无菌离心管中,2000转/分,离心5分钟,弃上清加入2ml冻存液,吹开分装到无菌冻存管中,立即置于-80℃暂存或直接放入-196℃液氮中长期保存。②流感病毒的培养:将流感病毒原液05～1ml加入长满细胞的培养瓶中,37℃ 5% CO2作用1小时,弃病毒悬液,加入含终浓度5μg/ml胰酶的病毒维持液,37℃ 5% CO2 中培养,大约72小时,细胞变圆、拉丝、脱落达80%左右时,即可收获,放入-20℃冰箱中冻存备用。使用时反复冻融3次,高速离心后即可收获。
体内抗流感病毒试验:①肺指数的测定:取健康昆明小鼠60只,雌雄各半,按体重随机分成6组,分别为正常组、模型组、病毒唑组、Tα1高剂量组、Tα1中剂量组、Tα1低剂量组,每组10只。除正常组外,其余各组小鼠在乙醚轻度麻醉下,滴鼻接种15 LD50的甲型流感病毒液,每只01ml。感染后第2天,药物组开始给药。阳性对照组每天肌肉注射病毒唑(130mg/kg),每只02ml,连续注射7天;受试药Tα1高(08mg/kg)、中(04mg/kg)、低剂量组(02mg/kg)隔日给药,肌肉注射,每只02ml,共注射7次。正常组和模型组每天肌注生理盐水,每只02ml,连续注射7次。上述小鼠按常规方法饲养,连续观察14天。将各组小鼠称体重后,拉颈处死解剖,观察肺部病变,流感病毒感染后肺部呈不同程度肝样实变,模型组最为严重。摘取全肺称重,并计算肺指数,求出肺指数抑制率[1]。肺指数值越大,肺病变程度越严重。②肺病变组织学和病理学检查:取各试验组鼠肺、固定、包埋、切片染色、镜检等,具体方法略。
药物效果计算:肺指数=肺重/体重×100%。肺指数抑制率=(模型对照组平均肺指数-药物组平均肺指数)/模型对照组平均指数×100%。
统计学方法:数据用X±S表示,组间资料比较用t检验。
结 果
Tα1对小鼠流感病毒性肺炎肺指数的影响结果:实验结果显示,正常对照组与模型组的肺指数差异有显著性(P<001),提示制造模型成功;病毒唑组肺指数与模型组比,差异有显著性(P<001),表明实验结果可靠。病毒唑、Tα1 08mg/kg、04mg/kg、02mg/kg剂量组的肺指数分别为110、115、121、129;肺指数抑制率分别为2126%、1741%、1310%、766%。其中04mg/(kg•日)、08mg/(kg•日)剂量组与模型组相比,能明显降低小鼠肺指数值(P<005,P<001),减轻肺病变严重程度。见表1。
肺病变组织学和病理学检查结果:病毒性肺炎模型组镜下可见支气管、细支气管壁、肺泡壁等肺间质充血、水肿,肺泡壁增宽,肺泡呈炎症反应。Tα1治疗组(02mg/kg、04mg/kg和08mg/kg)与模型组比,鼠肺病变程度明显减轻,部分肺组织形态结构接近正常,最佳治疗剂量为08mg/kg。
讨 论
Tα1是一种主要作用于T淋巴细胞的免疫调节剂,可促进T细胞分化、发育和成熟,促进成熟T细胞产生干扰素-α、γ、白细胞介素2(IL-2)及表达IL-2等受体,增强TH细胞、TC细胞和NK细胞的活性。动物实验证明,它可增强机体的细胞免疫和体液免疫功能,提高机体对病毒的防御能力,从而有利于病毒的清除。为了考察其药效学作用,本课题进行了Tα1体内抗流感病毒的研究。
笔者建立了甲型流感病毒感染的小鼠实验模型,并考察了不同浓度药物对小鼠肺指数的影响。在一定范围内,小鼠感染流感病毒后引起小鼠肺炎,其肺重增加,肺指数也相应增加,因而肺指数可作为评价药物是否具有抗流感病毒作用的指标。实验结果显示,Tα1 04mg/kg和08mg/kg两个剂量组对小鼠流感病毒性肺炎有明显的抑制作用,能明显降低小鼠肺指数(P<005,P<001),减轻流感病毒引起的小鼠肺部炎症病变程度。08mg/kg剂量对流感病毒的体内抑制效果与病毒唑相当,无显著性差异(P>005)。肺组织病理学研究显示模型组肺脏呈重度间质性肺炎病变,可见肺泡间隔增厚,肺泡腔内有浆液性惨出。Tα1治疗组与模型组相比,肺病变明显减轻,部分肺组织形态结构接近正常。提示Tα1具有较好的体内抗流感病毒作用,但是关于该药抗流感病毒的作用机制还有待进一步深入研究。
参考文献
1 简华香,徐培平.姜菊茶防治流感病毒作用研究.中药材.2005,28(8):698-69.
材料与方法
实验材料:①实验药物:胸腺肽α1(Tα1),受试药物,1.5mg/支,试验时用生理盐水分别配成002mg/ml、004mg/ml、008mg/ml低、中、高三个浓度,分装三个青霉素小瓶中备用。病毒唑(利巴韦林注射液),阳性对照药物,含量为100mg/ml。试验时用生理盐水配成13mg/ml浓度的药液。病毒株为流感病毒鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1),本实验室保存。在MDCK细胞中的组织半数感染量(TCID50)为10-4。细胞为狗肾细胞(MDCK),本实验室保存。②实验动物:健康昆明小鼠,雌雄各半,3～4周龄,体重18～20g,雌雄分别分组,由实验动物中心提供。合格证号:SCXK(吉)2003-0001。③实验试剂及用品:IMDM、小牛血清、青霉素、链霉素、培养瓶、细胞培养板、胰蛋白酶、EDTA、PBS(磷酸盐缓冲液)、MTT(四甲基偶氮唑盐)、DMSO(二甲基亚砜)。④实验仪器:CO2孵育箱、超净工作台、倒置显微镜、台式离心机、干燥箱、电冰箱、-80℃超低温冰箱、电热恒温培养箱、自动酶标仪。
实验方法:①细胞复苏、传代及冻存:细胞复苏,从液氮罐中取出冻存的MDCK细胞,迅速投入37℃水浴,融化后2000转/分,离心5分钟,弃上清,加少许IMDM培养液,反复吹打后加入到含有5ml培养液的培养瓶中,低倍镜下观察细胞悬浮情况,37℃ 5% CO2的培养箱中培养。细胞传代为待细胞贴壁长满,弃细胞培养液,以7:1的比例加入002%EDTA和025%胰酶消化,最好置CO2培养箱5～10分钟,可通过显微镜观察细胞收缩情況,待细胞完全收缩变圆后,停止消化,弃去消化液,加入IMDM生长液,反复吹打分散细胞,加入细胞培养液按1:3比例传代。细胞冻存,细胞长满瓶后一般在冻存前一天换液,用EDTA和胰酶消化至镜下细胞变圆,细胞之间距离变大,用无菌吸管将其吸至一个过酸无菌离心管中,2000转/分,离心5分钟,弃上清加入2ml冻存液,吹开分装到无菌冻存管中,立即置于-80℃暂存或直接放入-196℃液氮中长期保存。②流感病毒的培养:将流感病毒原液05～1ml加入长满细胞的培养瓶中,37℃ 5% CO2作用1小时,弃病毒悬液,加入含终浓度5μg/ml胰酶的病毒维持液,37℃ 5% CO2 中培养,大约72小时,细胞变圆、拉丝、脱落达80%左右时,即可收获,放入-20℃冰箱中冻存备用。使用时反复冻融3次,高速离心后即可收获。
体内抗流感病毒试验:①肺指数的测定:取健康昆明小鼠60只,雌雄各半,按体重随机分成6组,分别为正常组、模型组、病毒唑组、Tα1高剂量组、Tα1中剂量组、Tα1低剂量组,每组10只。除正常组外,其余各组小鼠在乙醚轻度麻醉下,滴鼻接种15 LD50的甲型流感病毒液,每只01ml。感染后第2天,药物组开始给药。阳性对照组每天肌肉注射病毒唑(130mg/kg),每只02ml,连续注射7天;受试药Tα1高(08mg/kg)、中(04mg/kg)、低剂量组(02mg/kg)隔日给药,肌肉注射,每只02ml,共注射7次。正常组和模型组每天肌注生理盐水,每只02ml,连续注射7次。上述小鼠按常规方法饲养,连续观察14天。将各组小鼠称体重后,拉颈处死解剖,观察肺部病变,流感病毒感染后肺部呈不同程度肝样实变,模型组最为严重。摘取全肺称重,并计算肺指数,求出肺指数抑制率[1]。肺指数值越大,肺病变程度越严重。②肺病变组织学和病理学检查:取各试验组鼠肺、固定、包埋、切片染色、镜检等,具体方法略。
药物效果计算:肺指数=肺重/体重×100%。肺指数抑制率=(模型对照组平均肺指数-药物组平均肺指数)/模型对照组平均指数×100%。
统计学方法:数据用X±S表示,组间资料比较用t检验。
结 果
Tα1对小鼠流感病毒性肺炎肺指数的影响结果:实验结果显示,正常对照组与模型组的肺指数差异有显著性(P<001),提示制造模型成功;病毒唑组肺指数与模型组比,差异有显著性(P<001),表明实验结果可靠。病毒唑、Tα1 08mg/kg、04mg/kg、02mg/kg剂量组的肺指数分别为110、115、121、129;肺指数抑制率分别为2126%、1741%、1310%、766%。其中04mg/(kg•日)、08mg/(kg•日)剂量组与模型组相比,能明显降低小鼠肺指数值(P<005,P<001),减轻肺病变严重程度。见表1。
肺病变组织学和病理学检查结果:病毒性肺炎模型组镜下可见支气管、细支气管壁、肺泡壁等肺间质充血、水肿,肺泡壁增宽,肺泡呈炎症反应。Tα1治疗组(02mg/kg、04mg/kg和08mg/kg)与模型组比,鼠肺病变程度明显减轻,部分肺组织形态结构接近正常,最佳治疗剂量为08mg/kg。
讨 论
Tα1是一种主要作用于T淋巴细胞的免疫调节剂,可促进T细胞分化、发育和成熟,促进成熟T细胞产生干扰素-α、γ、白细胞介素2(IL-2)及表达IL-2等受体,增强TH细胞、TC细胞和NK细胞的活性。动物实验证明,它可增强机体的细胞免疫和体液免疫功能,提高机体对病毒的防御能力,从而有利于病毒的清除。为了考察其药效学作用,本课题进行了Tα1体内抗流感病毒的研究。
笔者建立了甲型流感病毒感染的小鼠实验模型,并考察了不同浓度药物对小鼠肺指数的影响。在一定范围内,小鼠感染流感病毒后引起小鼠肺炎,其肺重增加,肺指数也相应增加,因而肺指数可作为评价药物是否具有抗流感病毒作用的指标。实验结果显示,Tα1 04mg/kg和08mg/kg两个剂量组对小鼠流感病毒性肺炎有明显的抑制作用,能明显降低小鼠肺指数(P<005,P<001),减轻流感病毒引起的小鼠肺部炎症病变程度。08mg/kg剂量对流感病毒的体内抑制效果与病毒唑相当,无显著性差异(P>005)。肺组织病理学研究显示模型组肺脏呈重度间质性肺炎病变,可见肺泡间隔增厚,肺泡腔内有浆液性惨出。Tα1治疗组与模型组相比,肺病变明显减轻,部分肺组织形态结构接近正常。提示Tα1具有较好的体内抗流感病毒作用,但是关于该药抗流感病毒的作用机制还有待进一步深入研究。
参考文献
1 简华香,徐培平.姜菊茶防治流感病毒作用研究.中药材.2005,28(8):698-69.