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关键词腐烂茎线虫;化学药剂;微生物菌剂;触杀活性
腐烂茎线虫Ditylenchus destructor属于迁移性植物内寄生线虫，是国际上重要的检疫性线虫。该线虫寄主范围广，已知寄主大约120种，主要寄主为马铃薯和甘薯。由该线虫引起的病害在美国、加拿大、德国、法国、中国、日本、澳大利亚等国均有发生。近年来随着我国马铃薯、甘薯种植面积的不断扩大，该线虫的分布也越来越广。资料显示，腐烂茎线虫病在北京、天津、山东、河北、河南、江苏、新疆、甘肃等地均有发生，并以山东、河北两省的发生最为严重，已成为北方甘薯最严重的病害之一。该病害一般可造成甘薯和马铃薯减产30%～50%，严重时可减产80%以上，甚至绝收，严重威胁着马铃薯、甘薯等相关产业的发展。由于腐烂茎线虫抗逆性强且寄主范围极广，可在土壤、病残体中长期存活，对于该病害的防控极其困难，效果甚微。
化学防治是防控线虫病害的重要手段。漆永红等的研究发现，20%丁硫克百威乳油2000μg/mL和1.8%阿维菌素乳油180μg/mL对腐烂茎线虫的防治效果较好。张大帆等的研究表明，溴氰菊酯对马铃薯腐烂茎线虫具有一定的杀灭活性，且对其运动扩散和摄食能力具有较高的抑制活性。李鹏程等的研究结果表明，53.8%氢氧化铜水分散粒剂结合3%阿维菌素乳油1000倍液蘸根处理当归种苗，对由腐烂茎线虫引起的当归麻口病有良好的防治效果，且对当归生产安全，能有效提高当归的产量。但化学防治也存在一定的局限性，过去常用的甲基异柳磷、氯唑磷、丙溴磷、硫线磷、灭线磷、苯线磷等有机磷类和涕灭威、丁硫克百威等氨基甲酸酯类杀线虫剂，都因高毒及对生态环境的破坏而被禁用或限用。且目前多数研究将根结线虫作为药剂筛选的靶标，而部分化学药剂虽然对根结线虫等植物线虫有效但对于腐烂茎线虫的防效较差。夏彦飞等研究结果表明，100g/L吡虫啉可湿性粉剂处理花生根结线虫、程氏滑刃线虫、贝西滑刃线虫、松材线虫和腐烂茎线虫48h后致死率分别为91.00%、65.70%、45.70%、44.00%和9.67%，花生根结线虫对吡虫啉最为敏感，腐烂茎线虫最不敏感，因此有必要针对腐烂茎线虫进一步筛选高效、低毒、安全的化学药剂。
生物防治具有对非靶标生物安全、致毒作用小、环境兼容性好、不产生抗药性等优点，已成为防控腐烂茎线虫病害的重要手段。张国锋等的研究表明，施用30kg/hm2的厚孢轮枝菌（2.5亿孢子/g）和45kg/hm2的淡紫拟青霉颗粒剂（5亿孢子/g）可有效防治甘薯茎线虫，防治效果分别达70.94%和67.56%。有研究表明，苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis对腐烂茎线虫具有较高毒力，巨大芽胞杆菌B.megaterium菌株D45对腐烂茎线虫具有一定的杀线活性。Zeng等分离获得的芽胞杆菌菌株SMrs28的发酵液粗提物表现出较强的杀线虫活性，其主要化合物对腐烂茎线虫具有毒杀作用。因此，进一步开发、筛选高效的生物菌剂并对其使用方法进行合理优化，必将有助于腐烂茎线虫的防控。
本试验利用5种化学药剂和4种微生物菌剂进行腐烂茎线虫的室内触杀活性研究，通过设置不同浓度或用量处理，旨在筛选出对该线虫具有良好触杀效果的化学药剂和微生物菌剂，并进一步探索了化学药剂和微生物菌剂联合应用的效果，旨在为腐烂茎线虫的有效防治提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试化学药剂及推荐用量
20%噻唑膦水乳剂（EW）750～1000mL/667m2，山东海而三利生物化工有限公司;5%阿维菌素悬浮剂（SC）16～20mL/667m2，青岛奥迪斯生物科技有限公司;41.7%氟吡菌酰胺懸浮剂（SC）0.024～0.03mL/株，拜耳股份公司;70.00%噁霉灵可湿性粉剂（WP）1.25～1.75g/m2，青岛鑫润生物科技有限公司;5%高氯·甲维盐微乳剂（ME）6～12mL/667m2，佳木斯兴宇生物技术开发有限公司。
1.1.2供试微生物菌剂及推荐用量
有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂粉剂（DP）15kg/667m2（有效成分：枯草芽胞杆菌和黑曲霉），河北上瑞化工有限公司;20亿芽胞/g蜡质芽胞杆菌可湿性粉剂（WP）兑水稀600～1000倍，广东植物龙生物技术有限公司;10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌可湿性粉剂（WP）75～100g/667m2，保定市科绿丰生化科技有限公司;≥2亿孢子/g木霉菌肥效剂粉剂（DP）1600株/kg，山东省科学院生物研究所与无锡几丁生物新材料科技发展有限公司联合研制。
1.1.3供试线虫
腐烂茎线虫Ditylenchus destructor采自发病的甘薯，并转接于健康的甘薯薯块中进行扩繁，室温条件下保存于内蒙古农业大学园艺与植保学院植物病理研究室。
1.2试验方法
1.2.1线虫分离
采用改良的贝曼漏斗法从发病的甘薯薯块中分离线虫。
1.2.2线虫悬浮液制备
参考徐进军等的方法收集线虫，并制备线虫悬浮液（约1000条/mL），备用。
1.2.3药液的配制
化学药剂的配制：参考供试化学药剂说明书的推荐用量，将20%噻唑膦EW、5%阿维菌素SC、41.7%氟吡菌酰胺SC、70%噁霉灵WP、5%高氯·甲维盐ME分别配制成有效浓度为6.06、0.033、5.21、26.92、0.02 g/L的药液备用;分别将20%噻唑膦EW、41.7%氟吡菌酰胺SC和70%噁霉灵WP3种化学药剂稀释100倍（有效浓度分别为2.00、4.17、7.00g/L）、300倍（有效浓度分别为0.67、1.39、2.33g/L）和500倍（有效浓度分别为0.40、0.83、1.40g/L），备用。
微生物菌剂的配制：参考供试微生物菌剂说明书推荐的用量，将有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP、20亿芽胞/g蜡质芽胞杆菌WP、10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP、≥2亿孢子/g木霉菌肥效剂DP分别配制成500.00、8.33、66.67、83.00g/L的药液备用;在此基础上，分别按照增加25%和减少25%菌剂用量进行配制，备用。 复合药液的配制：按照推荐使用浓度或用量，将触杀活性效果好的3种化学药剂（20%噻唑膦EW、70%噁霉灵WP和41.7%氟吡菌酰胺SC）分别配制成有效浓度为6.06、26.92g/L和5.21g/L的药液，将2种微生物菌剂（有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP和10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP）分别配制成500.00g/L和66.67g/L的水溶液，再按照化学药剂与生物菌剂1：1的比例进行混合，配制复合药液。
1.2.4腐烂茎线虫的室内触杀试验
采用直接触杀法，用移液枪吸取100μL线虫悬浮液（含腐烂茎线虫约100条）至1.5mL离心管，3000r/min离心2min，弃上清液，加入配制好的药液1.5mL，与线虫振荡混合均匀后，用移液枪吸人到细胞培养板的小孔中，每个处理重复3次，以无菌水作为对照。用橡皮筋固定，放入聚乙烯塑料袋中，25℃恒温培养24、48、72 h后在显微镜下进行观察，记录腐烂茎线虫的总数以及死亡数。
1.3数据分析
计算腐烂茎线虫的死亡率和校正死亡率，并使用IBM SPSS Statistics 24对数据进行显著性分析。
线虫死亡率=死虫数/供试线虫数×100%;
校正死亡率=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）×100%。
2结果与分析
2.1化学药剂对腐烂茎线虫的室内触杀活性
2.1.1推荐浓度下5种化学药剂对腐烂茎线虫的室内触杀活性
结果表明，推荐浓度下药剂处理24 h，70%噁霉灵WP和20%噻唑膦EW对腐烂茎线虫的触杀效果最好，线虫校正死亡率分别达到58.44%和55.09%，均与其他药剂处理差异显著，但二者之间无显著差异;其次41.7%氟吡菌酰胺SC效果也较好，校正死亡率达到50.60%。药剂处理48h，70%噁霉灵WP对腐烂茎线虫的校正死亡率达75.23%，显著高于其他处理;20%噻唑膦EW的触杀效果次之，校正死亡率达70.27%;41.7%氟吡菌酰胺SC处理的线虫校正死亡率也达到了66.11%。药剂处理72 h，70%噁霉灵WP对腐烂茎线虫的触杀效果依然最好，线虫校正死亡率达87.32%，且与其他药剂处理差异显著;20%噻唑膦EW和41.7%氟吡菌酰胺SC对腐烂茎线虫的触杀效果次之，但二者差异不显著，线虫校正死亡率分别为75.24%和73.95%（表1）。推荐浓度下，5%高氯·甲维盐ME和5%阿维菌素SC对腐烂茎线虫的触杀效果较差，72h的线虫校正死亡率均未达到50%。
2.1.2不同稀释浓度下化学药剂对腐烂茎线虫的室内触杀活性
在推荐使用浓度的基础上，分别将20%噻唑膦EW、41.7%氟吡菌酰胺SC和70%噁霉灵WP稀释100、300、500倍，测定其对腐烂茎线虫的室内触杀活性。结果表明，3种化学药剂对腐烂茎线虫的触杀活性均随着稀释倍数的增加有所降低;在不同时问点（24、48、72h），各药剂稀释100倍时的线虫校正死亡率均为最高，且显著高于其他稀释倍数。
药剂处理24h，41.7%氟吡菌酰胺SC对腐烂茎线虫的触杀效果均最好，稀释100倍时的线虫校正死亡率最高，为38.16%，稀释300倍和500倍的线虫校正死亡率也分别达到35.47%和32.19%;其次为70%嗯霉灵WP，稀释100倍时的线虫校正死亡率为33.00%;20%噻唑膦EW效果较差，不同稀释倍数处理的线虫校正死亡率均未超过30%。
但随着时间的推移，3种药剂对腐烂茎线虫的触杀活性发生变化，在药剂处理48h和72h，20%噻唑膦EW和70%噁霉灵WP100倍稀释液的效果较好，药剂处理48h时，线虫校正死亡率分别达55.63%和55.24%，均显著高于41.7%氟吡菌酰胺SC100倍稀释液的线虫校正死亡率（43.49%）。药剂处理72h，3种药剂对腐烂茎线虫的触杀活性进一步增强，各浓度处理的线虫校正死亡率均高于50%;20%噻唑膦EW和70%噁霉灵WP100倍稀释液的线虫校正死亡率分别达84.61%和81.68%，且显著高于线虫校正死亡率为65.50%的41.7%氟吡菌酰胺SC 100倍稀释液;20%噻唑膦EW和70%噁霉灵WP 300倍稀释液的线虫校正死亡率也较高，分别达67.28%和68.76%（表2）。
2.2不同用量条件下微生物菌剂对腐烂茎线虫的室内触杀活性
推荐用量下不同时间点（24、48h和72h），有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP均好于其他菌剂处理，对腐烂茎线虫的触杀效果最为显著，24、48h和72h时线虫的校正死亡率分别达60.89%、69.14%和76.48%;其次为10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP，3个时间点线虫的校正死亡率分别达47.06%、55.77%和63.31%;而≥2亿孢子/g木霉菌肥效剂DP对腐烂茎线虫的触杀效果最不理想，
3个时间点的线虫校正死亡率均在30%以下（表3）。
增加25%用量后，有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP不同时间点（24、48h和72h）的触杀活性依然显著好于其他菌剂处理，24 h时腐烂茎线虫的校正死亡率达63.27%，但与推荐用量处理相比差异不显著;在48h和72h时，菌剂加量25%后表现出对腐烂茎线虫更强的触杀效果，线虫的校正死亡率分别达到82.39%和85.58%，显著好于推荐用量。其次为10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP加量25%，24h对腐烂茎線虫的校正死亡率达51.12%，但与推荐用量处理差异不显著;在处理48h和72h时，线虫的校正死亡率分别达到63.54%和73.45%，比推荐用量的触杀效果更为显著（表3）。
4种微生物菌剂分别减少用量25%对腐烂茎线虫的触杀效果有所减弱，但有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP对腐烂茎线虫的触杀效果仍然较好，72h时线虫的校正死亡率达63.47%;其次为10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP，72h时线虫的校正死亡率达58.94%（表3）。 2.3化学药剂与微生物菌剂复合使用对腐烂茎线虫的室内触杀活性
参考推荐使用浓度或用量，将筛选获得的触杀活性效果好的3种化学药剂（20%噻唑膦EW、70%噁霉灵WP、41.7%氟吡菌酰胺SC）和2种微生物菌剂（有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP、10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP）分别按照化学药剂与生物菌剂1：1的比例混合后进行室内触杀活性试验。结果表明：有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP与70%噁霉灵WP复合处理的效果最好，24h和48h的腐烂茎线虫校正死亡率分别达到79.53%和93.30%，均显著高于其他处理;有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP与20%噻唑膦EW复合处理后效果也较好，48h线虫的校正死亡率达81.68%;其他复合处理的效果也较好，24h的线虫校正死亡率均在60%以上（64.65%～70.16%），48h后线虫的校正死亡率均在70%以上（72.26%～77.78%）（表4）。
3讨论
噁霉灵作为一种常用杀菌剂，通常被应用于防治水稻立枯病、西瓜枯萎病等土传真菌病害。本研究发现了杀菌剂70%噁霉灵WP无论是在推荐浓度条件下还是经过不同稀释倍数对腐烂茎线虫均具有较好的触杀效果，是杀菌剂的新利用，有必要继续开展田间防控试验。
噻唑膦和氟吡菌酰胺是生产上常用的化学药剂，但由于氟吡菌酰胺成本较高，其使用范围受到了一定的影响，而噻唑膦的使用更为普遍。鲁旭鹏等的研究表明，10%噻唑膦颗粒剂2000倍液对黄瓜和番茄根结线虫病的防效分别为72.75%和67.79%，可有效抑制黄瓜和番茄根部根结的形成。本研究发现20%噻唑膦EW与41.70%氟吡菌酰胺SC对腐烂茎线虫具有较强的触杀效果，这与多位学者报道结果较为一致。例如，杨锋等报道，10%噻唑膦颗粒剂穴施可以有效防控甘薯茎线虫病，平均防效达94.68%;张淑玲报道，41.7%氟吡菌酰胺SC稀释200倍对腐烂茎线虫的触杀效果为61.93%。已有研究表明，氟吡菌酰胺水溶液对南方根结线虫和肾形盘旋线虫有较好的触杀作用，主要表现为麻痹作用，受药后的线虫活力下降直至虫体僵直死亡，但去除药剂冲洗线虫24h后部分线虫的活力可恢复。本研究也发现，41.70%氟吡菌酰胺SC在处理24h时对腐烂茎线虫的触杀效果较为明显，特别是在相同稀释倍数条件下，24h的线虫校正死亡率显著高于其他药剂，这可能是由于41.70%氟吡菌酰胺SC在短时间内对线虫具有较强的毒杀作用和击倒活性;但是随着处理时间的延长，该药剂对腐烂茎线虫的触杀效果有所减弱。与41.70%氟吡菌酰胺SC不同，20%噻唑膦EW在稀释条件下，短时间内（24h）对腐烂茎线虫的触杀效果并不突出，但随着处理时间的延长触杀效果逐渐增强，即使在较低浓度条件下也表现出较高的触杀活性。
阿維菌素和高氯·甲维盐也是经常用于线虫病害防控的药剂。本研究表明，这两种药剂对腐烂茎线虫的触杀效果不理想，这与高德良等的研究结果不一致;但张淑玲研究发现1.8%阿维菌素悬浮剂和3%高氯·甲维盐悬浮剂稀释200倍，72h时对腐烂茎线虫的校正死亡率仅为14.26%和9.36%，与本研究结果较为一致。
4种微生物菌剂对腐烂茎线虫的触杀活性试验表明，有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP对腐烂茎线虫表现出最强的触杀活性，而该菌剂的主要成分是黑曲霉和枯草芽胞杆菌。关于黑曲霉和枯草芽胞杆菌防治根结线虫和孢囊线虫的报道较多。李颂等研究发现，不同浓度的黑曲霉Snf009次生代谢产物均能降低番茄植株的根结指数和根结线虫种群数量;李婷等发现，用生防真菌黑曲霉NBC001发酵液2倍稀释液处理大豆孢囊线虫其24h的校正死亡率约90%，孵化抑制率在68%以上;张辉民等发现，曲霉属真菌HN214和HN132的发酵液对禾谷孢囊线虫的校正死亡率分别为99.66%和96.56%。高旭利等发现，枯草芽胞杆菌ZJSS能够有效抑制根结线虫的侵染和根结的形成，同时提高黄瓜产量;彭双等的研究表明，枯草芽胞杆菌发酵上清液稀释3倍处理24h杀线虫率达到95%以上。但是，多数研究是将根结线虫和孢囊线虫作为靶标，而本研究表明，以黑曲霉和枯草芽胞杆菌为主要成分的抗根结线虫菌剂对腐烂茎线虫也具有良好的触杀活性，今后有必要进一步开展田问试验，明确其对腐烂茎线虫病的防治效果，使得该菌剂拥有更为广阔的应用前景。
本研究表明，≥2亿孢子/g木霉菌肥效剂DP对腐烂茎线虫的触杀活性最差。许多研究表明，木霉菌作为生防因子可以用来防控根结线虫病害。马金慧等报道木霉TRI2发酵液在48h时可以100%杀死根结线虫，在盆栽试验中使黄瓜根结减退率达到63.5%，在田间对黄瓜根结线虫病的防治效果达到72.2%。但与根结线虫等其他植物线虫相比，腐烂茎线虫较为特殊，除了可以寄生植物之外，还可在木霉属Trichoderma、镰孢属Fusarium、葡萄孢属Botrytis、轮枝孢属Verticillium等约40个属70余种真菌上繁殖。一般来说，大多数木霉不仅不能抑制腐烂茎线虫生长，而且利于其繁殖;徐鹏刚研究发现，30℃条件下用长枝木霉T.longi-brachiatum接种1000条腐烂茎线虫，30d后繁殖线虫多达18750条。当然一些生防木霉菌株经过发酵，产生大量具有杀线虫活性的次级代谢产物，可能会对腐烂茎线虫具有一定的触杀作用，但与根结线虫等其他植物线虫相比，其对腐烂茎线虫的活性可能会减弱;如段玉玺等研究表明，哈茨木霉Snef85发酵液的5倍稀释液对根结线虫、水稻干尖线虫和大豆孢囊线虫的毒力均较强（处理48h校正死亡率94.18%～100%），但对腐烂茎线虫的毒力一般（处理48h校正死亡率55.64%）。
化学药剂与微生物菌剂复合使用可以有效减少化学药剂的使用量，对于线虫病害的绿色防控意义重大。而且，本研究发现二者的复合处理，比单一菌剂或药剂对腐烂茎线虫的触杀活性更高，使用效果更好。张桂娟等的研究发现，10%噻唑膦颗粒剂分别与黑曲霉Y61和3%芽胞杆菌微乳剂复合使用对土壤中根结线虫2龄幼虫均具有一定的抑制作用，对芹菜根结线虫病防治效果分别为75.3%和52.1%，且分别增产17.2%和2.7%。万景旺等利用枯草芽胞杆菌Jdm2分别与阿维菌素、苦参碱、印楝素、藜芦碱混用，表明生防菌与生物源农药混用可对黄瓜根结线虫的防治起到增效作用。本研究初步筛选出对腐烂茎线虫的触杀效果较为明显的2个复合处理——有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP与70%噁霉灵WP混合使用和有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP与20%噻唑膦EW混合使用，为腐烂茎线虫病害的防控提出了新的解决方法。
腐烂茎线虫Ditylenchus destructor属于迁移性植物内寄生线虫，是国际上重要的检疫性线虫。该线虫寄主范围广，已知寄主大约120种，主要寄主为马铃薯和甘薯。由该线虫引起的病害在美国、加拿大、德国、法国、中国、日本、澳大利亚等国均有发生。近年来随着我国马铃薯、甘薯种植面积的不断扩大，该线虫的分布也越来越广。资料显示，腐烂茎线虫病在北京、天津、山东、河北、河南、江苏、新疆、甘肃等地均有发生，并以山东、河北两省的发生最为严重，已成为北方甘薯最严重的病害之一。该病害一般可造成甘薯和马铃薯减产30%～50%，严重时可减产80%以上，甚至绝收，严重威胁着马铃薯、甘薯等相关产业的发展。由于腐烂茎线虫抗逆性强且寄主范围极广，可在土壤、病残体中长期存活，对于该病害的防控极其困难，效果甚微。
化学防治是防控线虫病害的重要手段。漆永红等的研究发现，20%丁硫克百威乳油2000μg/mL和1.8%阿维菌素乳油180μg/mL对腐烂茎线虫的防治效果较好。张大帆等的研究表明，溴氰菊酯对马铃薯腐烂茎线虫具有一定的杀灭活性，且对其运动扩散和摄食能力具有较高的抑制活性。李鹏程等的研究结果表明，53.8%氢氧化铜水分散粒剂结合3%阿维菌素乳油1000倍液蘸根处理当归种苗，对由腐烂茎线虫引起的当归麻口病有良好的防治效果，且对当归生产安全，能有效提高当归的产量。但化学防治也存在一定的局限性，过去常用的甲基异柳磷、氯唑磷、丙溴磷、硫线磷、灭线磷、苯线磷等有机磷类和涕灭威、丁硫克百威等氨基甲酸酯类杀线虫剂，都因高毒及对生态环境的破坏而被禁用或限用。且目前多数研究将根结线虫作为药剂筛选的靶标，而部分化学药剂虽然对根结线虫等植物线虫有效但对于腐烂茎线虫的防效较差。夏彦飞等研究结果表明，100g/L吡虫啉可湿性粉剂处理花生根结线虫、程氏滑刃线虫、贝西滑刃线虫、松材线虫和腐烂茎线虫48h后致死率分别为91.00%、65.70%、45.70%、44.00%和9.67%，花生根结线虫对吡虫啉最为敏感，腐烂茎线虫最不敏感，因此有必要针对腐烂茎线虫进一步筛选高效、低毒、安全的化学药剂。
生物防治具有对非靶标生物安全、致毒作用小、环境兼容性好、不产生抗药性等优点，已成为防控腐烂茎线虫病害的重要手段。张国锋等的研究表明，施用30kg/hm2的厚孢轮枝菌（2.5亿孢子/g）和45kg/hm2的淡紫拟青霉颗粒剂（5亿孢子/g）可有效防治甘薯茎线虫，防治效果分别达70.94%和67.56%。有研究表明，苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis对腐烂茎线虫具有较高毒力，巨大芽胞杆菌B.megaterium菌株D45对腐烂茎线虫具有一定的杀线活性。Zeng等分离获得的芽胞杆菌菌株SMrs28的发酵液粗提物表现出较强的杀线虫活性，其主要化合物对腐烂茎线虫具有毒杀作用。因此，进一步开发、筛选高效的生物菌剂并对其使用方法进行合理优化，必将有助于腐烂茎线虫的防控。
本试验利用5种化学药剂和4种微生物菌剂进行腐烂茎线虫的室内触杀活性研究，通过设置不同浓度或用量处理，旨在筛选出对该线虫具有良好触杀效果的化学药剂和微生物菌剂，并进一步探索了化学药剂和微生物菌剂联合应用的效果，旨在为腐烂茎线虫的有效防治提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试化学药剂及推荐用量
20%噻唑膦水乳剂（EW）750～1000mL/667m2，山东海而三利生物化工有限公司;5%阿维菌素悬浮剂（SC）16～20mL/667m2，青岛奥迪斯生物科技有限公司;41.7%氟吡菌酰胺懸浮剂（SC）0.024～0.03mL/株，拜耳股份公司;70.00%噁霉灵可湿性粉剂（WP）1.25～1.75g/m2，青岛鑫润生物科技有限公司;5%高氯·甲维盐微乳剂（ME）6～12mL/667m2，佳木斯兴宇生物技术开发有限公司。
1.1.2供试微生物菌剂及推荐用量
有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂粉剂（DP）15kg/667m2（有效成分：枯草芽胞杆菌和黑曲霉），河北上瑞化工有限公司;20亿芽胞/g蜡质芽胞杆菌可湿性粉剂（WP）兑水稀600～1000倍，广东植物龙生物技术有限公司;10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌可湿性粉剂（WP）75～100g/667m2，保定市科绿丰生化科技有限公司;≥2亿孢子/g木霉菌肥效剂粉剂（DP）1600株/kg，山东省科学院生物研究所与无锡几丁生物新材料科技发展有限公司联合研制。
1.1.3供试线虫
腐烂茎线虫Ditylenchus destructor采自发病的甘薯，并转接于健康的甘薯薯块中进行扩繁，室温条件下保存于内蒙古农业大学园艺与植保学院植物病理研究室。
1.2试验方法
1.2.1线虫分离
采用改良的贝曼漏斗法从发病的甘薯薯块中分离线虫。
1.2.2线虫悬浮液制备
参考徐进军等的方法收集线虫，并制备线虫悬浮液（约1000条/mL），备用。
1.2.3药液的配制
化学药剂的配制：参考供试化学药剂说明书的推荐用量，将20%噻唑膦EW、5%阿维菌素SC、41.7%氟吡菌酰胺SC、70%噁霉灵WP、5%高氯·甲维盐ME分别配制成有效浓度为6.06、0.033、5.21、26.92、0.02 g/L的药液备用;分别将20%噻唑膦EW、41.7%氟吡菌酰胺SC和70%噁霉灵WP3种化学药剂稀释100倍（有效浓度分别为2.00、4.17、7.00g/L）、300倍（有效浓度分别为0.67、1.39、2.33g/L）和500倍（有效浓度分别为0.40、0.83、1.40g/L），备用。
微生物菌剂的配制：参考供试微生物菌剂说明书推荐的用量，将有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP、20亿芽胞/g蜡质芽胞杆菌WP、10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP、≥2亿孢子/g木霉菌肥效剂DP分别配制成500.00、8.33、66.67、83.00g/L的药液备用;在此基础上，分别按照增加25%和减少25%菌剂用量进行配制，备用。 复合药液的配制：按照推荐使用浓度或用量，将触杀活性效果好的3种化学药剂（20%噻唑膦EW、70%噁霉灵WP和41.7%氟吡菌酰胺SC）分别配制成有效浓度为6.06、26.92g/L和5.21g/L的药液，将2种微生物菌剂（有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP和10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP）分别配制成500.00g/L和66.67g/L的水溶液，再按照化学药剂与生物菌剂1：1的比例进行混合，配制复合药液。
1.2.4腐烂茎线虫的室内触杀试验
采用直接触杀法，用移液枪吸取100μL线虫悬浮液（含腐烂茎线虫约100条）至1.5mL离心管，3000r/min离心2min，弃上清液，加入配制好的药液1.5mL，与线虫振荡混合均匀后，用移液枪吸人到细胞培养板的小孔中，每个处理重复3次，以无菌水作为对照。用橡皮筋固定，放入聚乙烯塑料袋中，25℃恒温培养24、48、72 h后在显微镜下进行观察，记录腐烂茎线虫的总数以及死亡数。
1.3数据分析
计算腐烂茎线虫的死亡率和校正死亡率，并使用IBM SPSS Statistics 24对数据进行显著性分析。
线虫死亡率=死虫数/供试线虫数×100%;
校正死亡率=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）×100%。
2结果与分析
2.1化学药剂对腐烂茎线虫的室内触杀活性
2.1.1推荐浓度下5种化学药剂对腐烂茎线虫的室内触杀活性
结果表明，推荐浓度下药剂处理24 h，70%噁霉灵WP和20%噻唑膦EW对腐烂茎线虫的触杀效果最好，线虫校正死亡率分别达到58.44%和55.09%，均与其他药剂处理差异显著，但二者之间无显著差异;其次41.7%氟吡菌酰胺SC效果也较好，校正死亡率达到50.60%。药剂处理48h，70%噁霉灵WP对腐烂茎线虫的校正死亡率达75.23%，显著高于其他处理;20%噻唑膦EW的触杀效果次之，校正死亡率达70.27%;41.7%氟吡菌酰胺SC处理的线虫校正死亡率也达到了66.11%。药剂处理72 h，70%噁霉灵WP对腐烂茎线虫的触杀效果依然最好，线虫校正死亡率达87.32%，且与其他药剂处理差异显著;20%噻唑膦EW和41.7%氟吡菌酰胺SC对腐烂茎线虫的触杀效果次之，但二者差异不显著，线虫校正死亡率分别为75.24%和73.95%（表1）。推荐浓度下，5%高氯·甲维盐ME和5%阿维菌素SC对腐烂茎线虫的触杀效果较差，72h的线虫校正死亡率均未达到50%。
2.1.2不同稀释浓度下化学药剂对腐烂茎线虫的室内触杀活性
在推荐使用浓度的基础上，分别将20%噻唑膦EW、41.7%氟吡菌酰胺SC和70%噁霉灵WP稀释100、300、500倍，测定其对腐烂茎线虫的室内触杀活性。结果表明，3种化学药剂对腐烂茎线虫的触杀活性均随着稀释倍数的增加有所降低;在不同时问点（24、48、72h），各药剂稀释100倍时的线虫校正死亡率均为最高，且显著高于其他稀释倍数。
药剂处理24h，41.7%氟吡菌酰胺SC对腐烂茎线虫的触杀效果均最好，稀释100倍时的线虫校正死亡率最高，为38.16%，稀释300倍和500倍的线虫校正死亡率也分别达到35.47%和32.19%;其次为70%嗯霉灵WP，稀释100倍时的线虫校正死亡率为33.00%;20%噻唑膦EW效果较差，不同稀释倍数处理的线虫校正死亡率均未超过30%。
但随着时间的推移，3种药剂对腐烂茎线虫的触杀活性发生变化，在药剂处理48h和72h，20%噻唑膦EW和70%噁霉灵WP100倍稀释液的效果较好，药剂处理48h时，线虫校正死亡率分别达55.63%和55.24%，均显著高于41.7%氟吡菌酰胺SC100倍稀释液的线虫校正死亡率（43.49%）。药剂处理72h，3种药剂对腐烂茎线虫的触杀活性进一步增强，各浓度处理的线虫校正死亡率均高于50%;20%噻唑膦EW和70%噁霉灵WP100倍稀释液的线虫校正死亡率分别达84.61%和81.68%，且显著高于线虫校正死亡率为65.50%的41.7%氟吡菌酰胺SC 100倍稀释液;20%噻唑膦EW和70%噁霉灵WP 300倍稀释液的线虫校正死亡率也较高，分别达67.28%和68.76%（表2）。
2.2不同用量条件下微生物菌剂对腐烂茎线虫的室内触杀活性
推荐用量下不同时间点（24、48h和72h），有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP均好于其他菌剂处理，对腐烂茎线虫的触杀效果最为显著，24、48h和72h时线虫的校正死亡率分别达60.89%、69.14%和76.48%;其次为10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP，3个时间点线虫的校正死亡率分别达47.06%、55.77%和63.31%;而≥2亿孢子/g木霉菌肥效剂DP对腐烂茎线虫的触杀效果最不理想，
3个时间点的线虫校正死亡率均在30%以下（表3）。
增加25%用量后，有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP不同时间点（24、48h和72h）的触杀活性依然显著好于其他菌剂处理，24 h时腐烂茎线虫的校正死亡率达63.27%，但与推荐用量处理相比差异不显著;在48h和72h时，菌剂加量25%后表现出对腐烂茎线虫更强的触杀效果，线虫的校正死亡率分别达到82.39%和85.58%，显著好于推荐用量。其次为10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP加量25%，24h对腐烂茎線虫的校正死亡率达51.12%，但与推荐用量处理差异不显著;在处理48h和72h时，线虫的校正死亡率分别达到63.54%和73.45%，比推荐用量的触杀效果更为显著（表3）。
4种微生物菌剂分别减少用量25%对腐烂茎线虫的触杀效果有所减弱，但有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP对腐烂茎线虫的触杀效果仍然较好，72h时线虫的校正死亡率达63.47%;其次为10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP，72h时线虫的校正死亡率达58.94%（表3）。 2.3化学药剂与微生物菌剂复合使用对腐烂茎线虫的室内触杀活性
参考推荐使用浓度或用量，将筛选获得的触杀活性效果好的3种化学药剂（20%噻唑膦EW、70%噁霉灵WP、41.7%氟吡菌酰胺SC）和2种微生物菌剂（有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP、10亿活芽胞/g枯草芽胞杆菌WP）分别按照化学药剂与生物菌剂1：1的比例混合后进行室内触杀活性试验。结果表明：有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP与70%噁霉灵WP复合处理的效果最好，24h和48h的腐烂茎线虫校正死亡率分别达到79.53%和93.30%，均显著高于其他处理;有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP与20%噻唑膦EW复合处理后效果也较好，48h线虫的校正死亡率达81.68%;其他复合处理的效果也较好，24h的线虫校正死亡率均在60%以上（64.65%～70.16%），48h后线虫的校正死亡率均在70%以上（72.26%～77.78%）（表4）。
3讨论
噁霉灵作为一种常用杀菌剂，通常被应用于防治水稻立枯病、西瓜枯萎病等土传真菌病害。本研究发现了杀菌剂70%噁霉灵WP无论是在推荐浓度条件下还是经过不同稀释倍数对腐烂茎线虫均具有较好的触杀效果，是杀菌剂的新利用，有必要继续开展田间防控试验。
噻唑膦和氟吡菌酰胺是生产上常用的化学药剂，但由于氟吡菌酰胺成本较高，其使用范围受到了一定的影响，而噻唑膦的使用更为普遍。鲁旭鹏等的研究表明，10%噻唑膦颗粒剂2000倍液对黄瓜和番茄根结线虫病的防效分别为72.75%和67.79%，可有效抑制黄瓜和番茄根部根结的形成。本研究发现20%噻唑膦EW与41.70%氟吡菌酰胺SC对腐烂茎线虫具有较强的触杀效果，这与多位学者报道结果较为一致。例如，杨锋等报道，10%噻唑膦颗粒剂穴施可以有效防控甘薯茎线虫病，平均防效达94.68%;张淑玲报道，41.7%氟吡菌酰胺SC稀释200倍对腐烂茎线虫的触杀效果为61.93%。已有研究表明，氟吡菌酰胺水溶液对南方根结线虫和肾形盘旋线虫有较好的触杀作用，主要表现为麻痹作用，受药后的线虫活力下降直至虫体僵直死亡，但去除药剂冲洗线虫24h后部分线虫的活力可恢复。本研究也发现，41.70%氟吡菌酰胺SC在处理24h时对腐烂茎线虫的触杀效果较为明显，特别是在相同稀释倍数条件下，24h的线虫校正死亡率显著高于其他药剂，这可能是由于41.70%氟吡菌酰胺SC在短时间内对线虫具有较强的毒杀作用和击倒活性;但是随着处理时间的延长，该药剂对腐烂茎线虫的触杀效果有所减弱。与41.70%氟吡菌酰胺SC不同，20%噻唑膦EW在稀释条件下，短时间内（24h）对腐烂茎线虫的触杀效果并不突出，但随着处理时间的延长触杀效果逐渐增强，即使在较低浓度条件下也表现出较高的触杀活性。
阿維菌素和高氯·甲维盐也是经常用于线虫病害防控的药剂。本研究表明，这两种药剂对腐烂茎线虫的触杀效果不理想，这与高德良等的研究结果不一致;但张淑玲研究发现1.8%阿维菌素悬浮剂和3%高氯·甲维盐悬浮剂稀释200倍，72h时对腐烂茎线虫的校正死亡率仅为14.26%和9.36%，与本研究结果较为一致。
4种微生物菌剂对腐烂茎线虫的触杀活性试验表明，有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP对腐烂茎线虫表现出最强的触杀活性，而该菌剂的主要成分是黑曲霉和枯草芽胞杆菌。关于黑曲霉和枯草芽胞杆菌防治根结线虫和孢囊线虫的报道较多。李颂等研究发现，不同浓度的黑曲霉Snf009次生代谢产物均能降低番茄植株的根结指数和根结线虫种群数量;李婷等发现，用生防真菌黑曲霉NBC001发酵液2倍稀释液处理大豆孢囊线虫其24h的校正死亡率约90%，孵化抑制率在68%以上;张辉民等发现，曲霉属真菌HN214和HN132的发酵液对禾谷孢囊线虫的校正死亡率分别为99.66%和96.56%。高旭利等发现，枯草芽胞杆菌ZJSS能够有效抑制根结线虫的侵染和根结的形成，同时提高黄瓜产量;彭双等的研究表明，枯草芽胞杆菌发酵上清液稀释3倍处理24h杀线虫率达到95%以上。但是，多数研究是将根结线虫和孢囊线虫作为靶标，而本研究表明，以黑曲霉和枯草芽胞杆菌为主要成分的抗根结线虫菌剂对腐烂茎线虫也具有良好的触杀活性，今后有必要进一步开展田问试验，明确其对腐烂茎线虫病的防治效果，使得该菌剂拥有更为广阔的应用前景。
本研究表明，≥2亿孢子/g木霉菌肥效剂DP对腐烂茎线虫的触杀活性最差。许多研究表明，木霉菌作为生防因子可以用来防控根结线虫病害。马金慧等报道木霉TRI2发酵液在48h时可以100%杀死根结线虫，在盆栽试验中使黄瓜根结减退率达到63.5%，在田间对黄瓜根结线虫病的防治效果达到72.2%。但与根结线虫等其他植物线虫相比，腐烂茎线虫较为特殊，除了可以寄生植物之外，还可在木霉属Trichoderma、镰孢属Fusarium、葡萄孢属Botrytis、轮枝孢属Verticillium等约40个属70余种真菌上繁殖。一般来说，大多数木霉不仅不能抑制腐烂茎线虫生长，而且利于其繁殖;徐鹏刚研究发现，30℃条件下用长枝木霉T.longi-brachiatum接种1000条腐烂茎线虫，30d后繁殖线虫多达18750条。当然一些生防木霉菌株经过发酵，产生大量具有杀线虫活性的次级代谢产物，可能会对腐烂茎线虫具有一定的触杀作用，但与根结线虫等其他植物线虫相比，其对腐烂茎线虫的活性可能会减弱;如段玉玺等研究表明，哈茨木霉Snef85发酵液的5倍稀释液对根结线虫、水稻干尖线虫和大豆孢囊线虫的毒力均较强（处理48h校正死亡率94.18%～100%），但对腐烂茎线虫的毒力一般（处理48h校正死亡率55.64%）。
化学药剂与微生物菌剂复合使用可以有效减少化学药剂的使用量，对于线虫病害的绿色防控意义重大。而且，本研究发现二者的复合处理，比单一菌剂或药剂对腐烂茎线虫的触杀活性更高，使用效果更好。张桂娟等的研究发现，10%噻唑膦颗粒剂分别与黑曲霉Y61和3%芽胞杆菌微乳剂复合使用对土壤中根结线虫2龄幼虫均具有一定的抑制作用，对芹菜根结线虫病防治效果分别为75.3%和52.1%，且分别增产17.2%和2.7%。万景旺等利用枯草芽胞杆菌Jdm2分别与阿维菌素、苦参碱、印楝素、藜芦碱混用，表明生防菌与生物源农药混用可对黄瓜根结线虫的防治起到增效作用。本研究初步筛选出对腐烂茎线虫的触杀效果较为明显的2个复合处理——有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP与70%噁霉灵WP混合使用和有效活菌数≥200.0亿/g抗根结线虫菌剂DP与20%噻唑膦EW混合使用，为腐烂茎线虫病害的防控提出了新的解决方法。