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背景:结核病（TB）是一种感染结核分枝杆菌（MTB）后所引起的造成全球死亡的主要单一传染病。[1]现有的诊断方法仍存在一定问题。外泌体是一种由脂质双分子层膜包裹的细胞外纳米囊泡（EVs）,其携带有多种不同成分,包括蛋白、脂质以及核酸（DNA、mRNA和ncRNAs）等。越来越来多的证据显示外泌体质膜可对核酸起保护作用。这些特殊的囊泡能够被机体几乎所有类型的细胞所分泌,并随后进入体液当中,故这些囊泡的来源极其广泛。在TB中,存在于TB患者体液中的外泌体中miRNAs的表达出现上调或下调,从而影响天然或宿主免疫反应导致TB发展的改变。由于外泌体出现在多种体液中,且miRNAs在外泌体中相对稳定,故外泌体miRNAs能为TB的早期和最小入侵式诊断提供一种新的生物标志物。已有不少文献报导miR-548参与肿瘤或抗病毒免疫反应,但其在结核病中的作用或作为活动性结核病的诊断价值仍不清楚。目的:构建结核分枝杆菌Ra/BCG感染外泌体的miRNAs谱,并研究外泌体miR-548o-3p作为活动性结核病诊断生物标志物的潜在价值（包括特异性和灵敏度）。方法:1.分离Ra/BCG感染的THP-1源Mφ上清中外泌体并利用TEM或WB分析鉴定外泌体THP-1细胞稳定传代后,在用对数生长期的Ra/BCG菌株感染之前,用200 nM弗伯醇（PMA）处理,使其被诱导分化成贴壁且吞噬能力更强的巨噬细胞（Mφ）。然后用Ra和BCG去刺激该Mφ,并以未感染细胞作为对照组,感染4 h后,用PBS冲洗掉胞外未被吞噬的细菌并加入新鲜培养基继续培养72h。收集Ra/BCG感染组或对照组细胞上清液,每组约35 mL的细胞上清利用超速离心法提取外泌体。超离纯化后的外泌体沉淀重悬于PBS缓冲液中并随后保存于-80℃。取50μL上述保存的外泌体PBS重悬液,使用2%多聚甲醛进行固定并利用1.5%磷钨酸进行负染,干燥后立即使用TEM观察重悬液中纳米颗粒的形态、大小和纯度。同时使用RIPA裂解液重悬并裂解超离外泌体沉淀,利用Western Blot分别检测外泌体的标识蛋白TSG-101和CD9,并以骨架蛋白β-actin做内参,分析这些蛋白在超离沉淀中的表达情况。2.Ra/BCG感染THP-1源Mφ上清外泌体总RNAs提取和small RNA测序以及测序数据生信分析采用TRIzol试剂裂解并提取外泌体中总RNA,并随后测定提取总RNA的浓度和检测其质量,合格总RNA样品送上海云序公司进行small RNA测序。对于small RNAs测序,经过Illumina测序仪测序,图像分析,碱基识别后,收获经过质控后的原始reads,然后去接头,去低质量reads,合并所有样品的trimmed reads,进行新miRNA预测。并将每个样品的trimmed reads比对到合并的人类pre-miRNAs数据库上。miRNA的原始表达量为统计比对到该成熟miRNA上的tag数,然后标准化miRNA的表达量。计算感染组和未感染组样品间的Fold change,并筛选出差异表达miRNAs。利用四种常用miRNA靶基因在线预测软件分析差异miRNA的靶基因,构建miRNA-mRNA网络。并对这些差异miRNA的潜在靶基因进行GO功能注释和Pathway分析,寻找差异miRNA可能在结核菌感染后发挥的生物功能或影响的信号通路。3.RT-qPCR验证差异miRNAs在结核、肺癌和健康组血浆外泌体中的相对表达水平收集24例结核患者、8例肺癌患者和8例健康志愿者血浆各1 mL,按照说明书要求利用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit提取血浆中外泌体并随后进行外泌体总RNA的分离,提取外泌体RNA时加入cel-miR-39（1.6×108copies/μL）作为外参控制。使用从每个外泌体中分离出来的约60 ng总RNA,按照miScriptⅡRT Kit操作说明使用加尾法将其反转录为cDNA,然后所得cDNA按miScript SYBR Green PCR Kit操作说明,加入外参控制cel-miR-39和目的差异miRNAs特异上游引物将其进行PCR扩增,扩增设置三孔平行。利用外参控制cel-miR-39标准化目的miRNAs的表达,然后用2-ΔΔCt计算结核组血浆外泌体中miRNAs相对于肿瘤或健康组的表达量。结果:1.分离Ra/BCG感染的THP-1源Mφ上清中外泌体并利用TEM或WB分析鉴定外泌体THP-1细胞在稳定传代培养,使用200 nM浓度的PMA处理24 h后,细胞形态变为不规则且紧密贴壁,说明其被成功诱导分化为具有更强吞噬能力的Mφ。在Ra/BCG刺激感染Mφ后,细胞形态变得更为不规则且聚集现象更明显,抗酸染色显示细胞中存在分枝杆菌,说明Ra/BCG感染模型构建成功。TEM检测超离外泌体沉淀,发现典型外泌体的杯盘外形,背景较为干净。免疫印迹检测显示,相较于超离后的细胞上清,超离后的沉淀高表达外泌体标识蛋白CD9和TSG-101,而内参β-actin表达水平没有差异。2.Ra/BCG感染THP-1源Mφ上清外泌体总RNAs提取和small RNA测序以及测序数据生信分析NanoDrop ND-1000测定Ra和BCG感染组以及未感染组外泌体总RNA的OD260/280比值分别为1.93、1.94和1.92,浓度分别为68.17、71.74和62.83ng/μL。测序文库使用Agilent DNA 1000 chip kit于Agilent 2100 Bioanalyzer上进行检测,Ra/BCG和未感染组文库大小分别为143、140和142 bp,浓度分别为1.26、0.99和0.67 ng/μL。通过序列比对,我们得到了细胞上清外泌体的miRNAs谱,包括novel-miRNAs在内,共有248（Ra组）、234（BCG组）和227（未感染组）个miRNAs。相比于未感染组,同时在Ra和BCG感染组显示上调的miRNAs有12个,显示下调的miRNAs有2个（reads≥10,|log2FC|≥1）。利用多个在线软件对这14个差异miRNAs进行靶基因预测分析并取交集,对所有预测得到的交集靶基因进行GO功能注释和KEGG信号通路分析,显示这些miRNAs对应的靶基因可能主要参与TGF-β、Ras、PI3K-Akt、Jak-STAT、内吞和cGMP-PKG信号通路,这些信号通路在机体免疫或炎症反应中起着关键性作用,甚至可能影响结核的发病状态或结核病的进展。3.RT-qPCR验证miR-548o-3p在结核、肺癌和健康组血浆外泌体中的相对表达水平结核组血浆外泌体miR-548o-3p的表达水平相较于健康组上调,P=0.0404,相较于肺癌对照组也表现出显著上调,p=0.0028。ROC曲线分析显示,在结核组和肺癌对照组进行比较时AUC=0.869,结核组和健康组比较时AUC=0.7738。结论:1.感染和未感染组均分离得到纯度较好的典型外泌体2.成功构建miRNA文库,Ra/BCG感染组和未感染组miRNA谱存在差异,且感染组中差异表达miRNAs可能调控结核免疫反应或信号通路3.血浆外泌体hsa-miR-548o-3p在作为活动性肺结核的鉴别诊断中具有一定价值