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【摘要】目的 探讨岩大戟内酯B对裸鼠移植MCF-7乳腺癌细胞生长抑制作用及其机理。 方法 雌性BALB/c裸鼠12只，接种MCF-7移植成瘤后分4组，分别为空白对照组；岩大戟内酯B组；5-Fu组；岩大戟内酯B+5-Fu组。每3天腹腔给药1次，持续4周，剥离瘤组织，通过计算肿瘤组织体积观察药物抗肿瘤作用；采用免疫组化观察药物对PI3K/Akt mTOR信号通路的影响。结果 各组根据肿瘤生长曲线分析，5-Fu组、岩大戟内酯B组、岩大戟内酯B+5-Fu组与空白对照组比较，有统计学差异（p<0.05）；免疫组化结果显示加药处理组与空白对照组比较，p-PK3K、p-AKT蛋白表达降低，mTOR蛋白表达增高（p<0.05）。结论 岩大戟内酯B对裸鼠MCF-7移植瘤的肿瘤组织生长明显抑制作用，并可能与抑制PI3K/Akt mTOR信号通路有关。
【关键词】岩大戟内酯B； MCF-7； PI3K/Akt mTOR
乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，近年来发病率逐年递增，生物治疗成为继放化疗、内分泌治疗后的另一种值得期待的保守治疗方法[1,2]。本实验拟采用人乳腺癌细胞MCF-7建立裸鼠移植瘤模型，观察岩大戟内酯B对移植瘤生长的作用，并对其作用机制初步探讨，为拓展岩大戟内酯B在抗肿瘤方面的開发及应用奠定基础。
1材料与方法
1.1细胞系和动物：MCF-7乳腺癌细胞由北京大学肿瘤医院肿瘤分子生物学研究室惠赠。雌性BALB/c裸鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，
1.2主要仪器和药物：岩大戟内酯B由齐齐哈尔大学提取，主要试剂DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone。p-PK3K、p-AKT、mTOR购于cell signal technology公司。
1.3实验方法
1.3.1细胞培养：细胞培养均在含5%(V/V)胎牛血清的DMEM培养基中，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，5%CO2 37℃条件下培养，隔48h换液，含0.25%胰酶和0.02%EDTA消化液隔天消化、传代。
1.3.2建立裸鼠移植瘤模型：将处于对数生长期的细胞浓度调整为1×107 cell/ml。无菌条件下，将人乳腺癌细胞MCF-7接种于裸小鼠腋下（细胞数为5×105 cell/只），12只BALB/c裸小鼠在造模后1周皮下明显触及肿块生长时随机分为空白对照组、岩大戟内酯B（40mg/kg）组、5Fu(5mg/kg)组、岩大戟内酯B+5Fu组，每组3只。给药组每3天腹腔注射一次，空白对照组腹腔注射等量的生理盐水，共用药3周。
1.3.3肿瘤体积的测量：用游标卡尺测量瘤块大小，每隔3 d测量1次。根据公式ab2/2计算瘤块的体积，a为长径，b为短径，绘制曲线。
1.3.4免疫组化：新鲜的瘤组织用4%的甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡脱水，经3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10min，抗原修复，PBS洗1次，滴加一抗（1:100），4℃孵育过夜；滴加二抗（1:200），室温孵育30分钟；DAB显色，苏木素复染，自来水返蓝，脱水，透明，树脂封片。
1.4统计学方法：采用SPSS17.0统计软件，计量资料比较采用两独立样本t检验、计数资料比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1岩大戟内酯B对裸鼠MCF-7移植瘤模型肿瘤生长和瘤体肿瘤的影响。各组根据肿瘤生长曲线分析，5-Fu组、岩大戟内酯B组、岩大戟内酯B+5-Fu组与空白对照组比较，有统计学差异（p<0.05）；（见表1）。
* 与对照组比较(p<0.05) ；** 与对照组比较(p<0.01)
2.2免疫组化实验结果：免疫组化结果显示加药处理组与空白对照组比较，p-PK3K、p-AKT蛋白表达降低，mTOR蛋白表达增高（p<0.05）。见表2。
*与对照组比较(p<0.05)
3讨论
岩大戟内酯B在体外实验中，可明显抑制MCF-7肿瘤细胞的生长，但对裸鼠还未见研究。本研究中，我们采用肿瘤组织生长曲线和免疫组化技术观察了岩大戟内酯B肿瘤组织生长的抑制和对PI3K/Akt mTOR信号通路的影响。结果显示，肿瘤组织生长曲线表明岩大戟内酯B可缩小肿瘤的体积，岩大戟内酯B+5-Fu组抑瘤效果最好。免疫组化测定，p-PK3K和p-AKT蛋白表达降低，同时mTOR蛋白表达增加。
因此，PI3K /Akt/mTOR被认为是蛋白质合成的主要信号调节通路，参与细胞增殖、分化、迁移等的调节。本研究显示岩大戟内酯B具有明显的抑瘤作用，抑制PI3K/Akt mTOR信号通路
参考文献
[1] 邓莉，王卫东，陈正堂. 重组人内皮抑素联合TP方案对MCF-7裸鼠移植瘤的影响[J].现代生物学进展。2008; 8（4）:635-638.
[2] 董海鹰，王知非，蔡莉.青蒿琥酯对人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤的作用及IGF_IR的影响[J].中国肿瘤.2008;17(12):1057-1060.
作者简介：许惠玉(1973-),女,2009级在读博士后,副教授，硕士研究生导师，研究方向：中药抗肿瘤
通讯作者：刘吉成，男, 医学博士，教授，主任药师，博士研究生导师
基金项目：国家自然科学基金资助(No. 30973902)
【关键词】岩大戟内酯B； MCF-7； PI3K/Akt mTOR
乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，近年来发病率逐年递增，生物治疗成为继放化疗、内分泌治疗后的另一种值得期待的保守治疗方法[1,2]。本实验拟采用人乳腺癌细胞MCF-7建立裸鼠移植瘤模型，观察岩大戟内酯B对移植瘤生长的作用，并对其作用机制初步探讨，为拓展岩大戟内酯B在抗肿瘤方面的開发及应用奠定基础。
1材料与方法
1.1细胞系和动物：MCF-7乳腺癌细胞由北京大学肿瘤医院肿瘤分子生物学研究室惠赠。雌性BALB/c裸鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，
1.2主要仪器和药物：岩大戟内酯B由齐齐哈尔大学提取，主要试剂DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone。p-PK3K、p-AKT、mTOR购于cell signal technology公司。
1.3实验方法
1.3.1细胞培养：细胞培养均在含5%(V/V)胎牛血清的DMEM培养基中，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，5%CO2 37℃条件下培养，隔48h换液，含0.25%胰酶和0.02%EDTA消化液隔天消化、传代。
1.3.2建立裸鼠移植瘤模型：将处于对数生长期的细胞浓度调整为1×107 cell/ml。无菌条件下，将人乳腺癌细胞MCF-7接种于裸小鼠腋下（细胞数为5×105 cell/只），12只BALB/c裸小鼠在造模后1周皮下明显触及肿块生长时随机分为空白对照组、岩大戟内酯B（40mg/kg）组、5Fu(5mg/kg)组、岩大戟内酯B+5Fu组，每组3只。给药组每3天腹腔注射一次，空白对照组腹腔注射等量的生理盐水，共用药3周。
1.3.3肿瘤体积的测量：用游标卡尺测量瘤块大小，每隔3 d测量1次。根据公式ab2/2计算瘤块的体积，a为长径，b为短径，绘制曲线。
1.3.4免疫组化：新鲜的瘤组织用4%的甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡脱水，经3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10min，抗原修复，PBS洗1次，滴加一抗（1:100），4℃孵育过夜；滴加二抗（1:200），室温孵育30分钟；DAB显色，苏木素复染，自来水返蓝，脱水，透明，树脂封片。
1.4统计学方法：采用SPSS17.0统计软件，计量资料比较采用两独立样本t检验、计数资料比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1岩大戟内酯B对裸鼠MCF-7移植瘤模型肿瘤生长和瘤体肿瘤的影响。各组根据肿瘤生长曲线分析，5-Fu组、岩大戟内酯B组、岩大戟内酯B+5-Fu组与空白对照组比较，有统计学差异（p<0.05）；（见表1）。
* 与对照组比较(p<0.05) ；** 与对照组比较(p<0.01)
2.2免疫组化实验结果：免疫组化结果显示加药处理组与空白对照组比较，p-PK3K、p-AKT蛋白表达降低，mTOR蛋白表达增高（p<0.05）。见表2。
*与对照组比较(p<0.05)
3讨论
岩大戟内酯B在体外实验中，可明显抑制MCF-7肿瘤细胞的生长，但对裸鼠还未见研究。本研究中，我们采用肿瘤组织生长曲线和免疫组化技术观察了岩大戟内酯B肿瘤组织生长的抑制和对PI3K/Akt mTOR信号通路的影响。结果显示，肿瘤组织生长曲线表明岩大戟内酯B可缩小肿瘤的体积，岩大戟内酯B+5-Fu组抑瘤效果最好。免疫组化测定，p-PK3K和p-AKT蛋白表达降低，同时mTOR蛋白表达增加。
因此，PI3K /Akt/mTOR被认为是蛋白质合成的主要信号调节通路，参与细胞增殖、分化、迁移等的调节。本研究显示岩大戟内酯B具有明显的抑瘤作用，抑制PI3K/Akt mTOR信号通路
参考文献
[1] 邓莉，王卫东，陈正堂. 重组人内皮抑素联合TP方案对MCF-7裸鼠移植瘤的影响[J].现代生物学进展。2008; 8（4）:635-638.
[2] 董海鹰，王知非，蔡莉.青蒿琥酯对人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤的作用及IGF_IR的影响[J].中国肿瘤.2008;17(12):1057-1060.
作者简介：许惠玉(1973-),女,2009级在读博士后,副教授，硕士研究生导师，研究方向：中药抗肿瘤
通讯作者：刘吉成，男, 医学博士，教授，主任药师，博士研究生导师
基金项目：国家自然科学基金资助(No. 30973902)