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摘要通过沙丁胺醇与对氨基苯甲酸反应，制备出沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒，试剂盒对样品中沙丁胺醇的捕获量为20 ng/mL，与沙丁胺醇结构或者功能相似的竞争药物：克仑特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特罗、溴布特罗、特布他林、羟甲基沙丁胺醇、西马特罗、妥布特罗、马喷特罗、赛布特罗、克仑潘特、奇帕特罗、喷布特罗、克仑丙罗、马布特罗、氯丙那林等17种药物进行特异性反应时，均无交叉反应。
关键词沙丁胺醇;单克隆抗体;免疫磁珠分离富集试剂盒
中图分类号S859.79文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）03-0137-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.043
沙丁胺醇（Salbutamol，SAL）是一种选择性β2受体激动剂，该种药物具有扩张支气管的作用，因此，医疗上常常用来治疗喘息性支气管炎、支气管哮喘等疾病。除了能够扩张支气管，沙丁胺醇还能促进动物骨骼肌生长、减少蓄积脂肪，一些养殖场非法将沙丁胺醇添加到动物饲料中，用来提高其瘦肉率。在人食用高含量沙丁胺醇的动物源性食品后，会出现恶心、呕吐、肌肉疼痛等症状[1-6]。我国农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中明确规定：沙丁胺醇等β-兴奋剂类药物禁用于所有食品动物。
目前，检测沙丁胺醇残留的方法主要有液相色谱-串联质谱法、毛细管区带电泳法、高效液相色谱法、气相色谱-质譜法等。上述方法对样本进行提取纯化时，需要色谱柱等净化装置，这些装置不仅操作较为繁琐，而且价格较为昂贵[7-10]。沙丁胺醇免疫磁珠通过内含四氧化三铁的纳米磁珠表面修饰官能团与沙丁胺醇抗体结合，在外加磁场作用下，从混合溶液中富集、分离沙丁胺醇，操作步骤简单，试验成本较低。该研究利用免疫磁珠分离技术检测动物尿液和动物组织中的沙丁胺醇残留量，为致力于食品安全检测的基层实验室提供检测方法。
1材料与方法
1.1材料与试剂
沙丁胺醇标准品 CAS：1219798-60-3，购自北京标准物质研究中心;氨基苯甲酸、乙酸乙酯、甲醇、盐酸、牛血清白蛋白、鲁米诺，购自北京百欣试剂公司;猪尿和猪肉，市售;小鼠脾细胞、沙丁胺醇残留酶联免疫检测试剂盒（以下简称“ELISA试剂盒”），产自北京勤邦生物技术有限公司。
1.2仪器与设备
MX-F涡旋仪：湖南湘立科学仪器有限公司;MK3酶标仪：上海雷勃分析仪器有限公司。
1.3方法
1.3.1制备抗原。
1.3.1.1半抗原的制备。
取0.5 g对氨基苯甲酸，加入到300 μL 1mol/L盐酸溶液中，再加入4 mL蒸馏水稀释，冷却至0 ℃并搅拌，加入0.23 g亚硝酸钠，继续搅拌2 h，得到重氮盐溶液。取0.7 g沙丁胺醇，用甲醇溶解，向其中加入0.21 g氢氧化钠，搅拌，加入重氮盐溶液，继续搅拌4 h，停止反应，加入稀盐酸调节pH至5.0，加乙酸乙酯萃取，分去水相，将有机相蒸干，加入乙醚重结晶得到沙丁胺醇半抗原产物0.61 g，收率为87%，沙丁胺醇半抗原的合成路线见图1。
1.3.1.2免疫原的制备。
取9 mg沙丁胺醇半抗原，溶解于1 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中;取30 mg二氯乙烷（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2 mL水充分溶解后，加入半抗原溶液中，室温下搅拌24 h，即可得到反应液A;称取牛血清白蛋白（BSA）50 mL，使之充分溶解在3.8 mL pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到BSA溶液中，并于室温下搅拌24 h;用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液于4 ℃透析3 d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到沙丁胺醇免疫原;分装，于-20 ℃保存备用。
1.3.2制备单克隆抗体、偶联单抗的磁珠。
将“1.3.1”得到的沙丁胺醇免疫原依次进行动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、单克隆抗体制备等操作[16]，最终得到沙丁胺醇单克隆抗体。
将10 μg沙丁胺醇单克隆抗体溶解到60 μL、pH 5.0、0.25 mmol/L的2-（N-吗啉）乙磺酸一水合物（MES）中，向其中加入5 mg活化的磁珠，并用上述浓度MES溶液调节总体积至100 μL，轻轻混匀磁珠与沙丁胺醇单克隆抗体;室温下偶联30 min，可利用涡旋仪使磁珠保持混匀状态;离心管置于磁分离架上进行磁分离5 min，移除上清液;为了淬灭未反应的-COOH，可加入100 μL，pH 7.2～7.6的三羟甲基氨基甲烷（TRIS）反应封闭磁珠;用100 μL、0.2%BSA、0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗封闭好的磁珠3～5次，将磁珠复溶于含0.3%的BSA、0.08%吐温-20/0.02%NaN5的磷酸盐缓冲液中，于2～8 ℃保藏。所述百分含量为质量百分含量。
1.3.3试剂盒对样本中沙丁胺醇的分离富集方法。
1.3.3.1取溶于偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠复溶液0.1 mL于10 mL离心管中，用5 mL去离子水润洗磁珠1～2次，将离心管在磁铁上静置2～3 min，确保磁珠全部吸附在磁铁上，每次用磁铁分离磁珠和洗液。
1.3.3.2将尿液样本5mL加入到装有润洗好的偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠的10 mL离心管中，混匀，室温下反应20 min，或者将动物组织样本用均质器均质后，称取5.0样本至样本瓶中，分别加入1.5 g氯化钠、20 mL 50%甲醇溶液，用涡旋仪涡旋5 min，室温下3 000 r/min离心5 min，吸取5 mL离心上清液，加入5mL去离子水，混匀，吸取离心上清液与去离子水的混合液5 mL与偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠混匀，在室温下反应20 min。 1.3.3.3反应完成后，用磁铁分离磁珠，用5 mL去离子水清洗磁珠，清洗2次。
1.3.3.4将1 mL甲醇加入到装有经过步骤（3）清洗过的磁珠的10 mL离心管中，混匀，静置1 min，用磁铁分离磁珠，回收甲醇溶液，用于检测分析。
1.3.4试剂盒的捕获量和回收率测定方法。
试剂盒的捕获量指每毫克偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠可以捕获沙丁胺醇的最大量。
制备沙丁胺醇浓度分别为10、15、20、25、30 ng/mL的样本溶液，每份猪尿、猪肉样本溶液为1 mL，取沙丁胺醇单克隆抗体免疫磁珠0.1mL分别加入至上述样本中，用试剂盒进行样本中沙丁胺醇的分离和富集，并用ELISA试剂盒对用偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠处理过样本进行检测。
1.3.5试剂盒的特异性测定方法。
以沙丁胺醇作为标准，设沙丁胺醇的交叉反应率为100%，用于试剂盒交叉反应性研究的药物均为与沙丁胺醇结构或者功能相似的竞争药物：克仑特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特罗、溴布特罗、特布他林、羟甲基沙丁胺醇、西马特罗、妥布特罗、马喷特罗、赛布特罗、克仑潘特、奇帕特罗、喷布特罗、克仑丙罗、马布特罗、氯丙那林。猪尿、猪肉样本中分别添加上述18种药物（包括沙丁胺醇）浓度为20 ng/mL，按照试剂盒步骤操作，对样本中沙丁胺醇进行分离富集后，利用ELISA试剂盒方法对样本进行检测。
2结果与分析
2.1试剂盒的捕获量
由表1可知，样本中沙丁胺醇浓度为10、15、20 ng/mL时，经沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒对样本中沙丁胺醇分离富集后，再经ELISA试剂盒进行检测，得出沙丁胺醇添加回收率范围为93.5%～98.5%;样本中沙丁胺醇浓度为25、30 ng/mL時，得出沙丁胺醇添加回收率范围为65.0%～76.8%，表明沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒对样品中沙丁胺醇的捕获量为20 ng/mL。
2.2特异性
从表2可以看出，试剂盒对沙丁胺醇具有较高的特异性，对与沙丁胺醇结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。
3结论与讨论
目前，在检测方法中，一般都需要对目标物进行前处理，达到分离富集的作用。较常用的前处理净化装置，包括C18柱、石墨化碳固相萃取柱、硅土固相萃取柱、硅胶SPE固相萃取柱等[11-22]。以上净化装置费用较高，不适于基层实验室大量使用。该研究的沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒价格合适，用于后期检测的灵敏度也较好。
该研究制备了抗沙丁胺醇单克隆抗体，并研发出沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒，试剂盒对样品中沙丁胺醇的捕获量为20 ng/mL，与沙丁胺醇结构或者功能相似的竞争药物：克仑特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特罗、溴布特罗、特布他林、羟甲基沙丁胺醇、西马特罗、妥布特罗、马喷特罗、赛布特罗、克仑潘特、奇帕特罗、喷布特罗、克仑丙罗、马布特罗、氯丙那林等17种药物进行特异性反应时，均无交叉反应，说明试剂盒对沙丁胺醇具有较高的特异性。
参考文献
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关键词沙丁胺醇;单克隆抗体;免疫磁珠分离富集试剂盒
中图分类号S859.79文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）03-0137-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.043
沙丁胺醇（Salbutamol，SAL）是一种选择性β2受体激动剂，该种药物具有扩张支气管的作用，因此，医疗上常常用来治疗喘息性支气管炎、支气管哮喘等疾病。除了能够扩张支气管，沙丁胺醇还能促进动物骨骼肌生长、减少蓄积脂肪，一些养殖场非法将沙丁胺醇添加到动物饲料中，用来提高其瘦肉率。在人食用高含量沙丁胺醇的动物源性食品后，会出现恶心、呕吐、肌肉疼痛等症状[1-6]。我国农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中明确规定：沙丁胺醇等β-兴奋剂类药物禁用于所有食品动物。
目前，检测沙丁胺醇残留的方法主要有液相色谱-串联质谱法、毛细管区带电泳法、高效液相色谱法、气相色谱-质譜法等。上述方法对样本进行提取纯化时，需要色谱柱等净化装置，这些装置不仅操作较为繁琐，而且价格较为昂贵[7-10]。沙丁胺醇免疫磁珠通过内含四氧化三铁的纳米磁珠表面修饰官能团与沙丁胺醇抗体结合，在外加磁场作用下，从混合溶液中富集、分离沙丁胺醇，操作步骤简单，试验成本较低。该研究利用免疫磁珠分离技术检测动物尿液和动物组织中的沙丁胺醇残留量，为致力于食品安全检测的基层实验室提供检测方法。
1材料与方法
1.1材料与试剂
沙丁胺醇标准品 CAS：1219798-60-3，购自北京标准物质研究中心;氨基苯甲酸、乙酸乙酯、甲醇、盐酸、牛血清白蛋白、鲁米诺，购自北京百欣试剂公司;猪尿和猪肉，市售;小鼠脾细胞、沙丁胺醇残留酶联免疫检测试剂盒（以下简称“ELISA试剂盒”），产自北京勤邦生物技术有限公司。
1.2仪器与设备
MX-F涡旋仪：湖南湘立科学仪器有限公司;MK3酶标仪：上海雷勃分析仪器有限公司。
1.3方法
1.3.1制备抗原。
1.3.1.1半抗原的制备。
取0.5 g对氨基苯甲酸，加入到300 μL 1mol/L盐酸溶液中，再加入4 mL蒸馏水稀释，冷却至0 ℃并搅拌，加入0.23 g亚硝酸钠，继续搅拌2 h，得到重氮盐溶液。取0.7 g沙丁胺醇，用甲醇溶解，向其中加入0.21 g氢氧化钠，搅拌，加入重氮盐溶液，继续搅拌4 h，停止反应，加入稀盐酸调节pH至5.0，加乙酸乙酯萃取，分去水相，将有机相蒸干，加入乙醚重结晶得到沙丁胺醇半抗原产物0.61 g，收率为87%，沙丁胺醇半抗原的合成路线见图1。
1.3.1.2免疫原的制备。
取9 mg沙丁胺醇半抗原，溶解于1 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中;取30 mg二氯乙烷（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2 mL水充分溶解后，加入半抗原溶液中，室温下搅拌24 h，即可得到反应液A;称取牛血清白蛋白（BSA）50 mL，使之充分溶解在3.8 mL pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到BSA溶液中，并于室温下搅拌24 h;用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液于4 ℃透析3 d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到沙丁胺醇免疫原;分装，于-20 ℃保存备用。
1.3.2制备单克隆抗体、偶联单抗的磁珠。
将“1.3.1”得到的沙丁胺醇免疫原依次进行动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、单克隆抗体制备等操作[16]，最终得到沙丁胺醇单克隆抗体。
将10 μg沙丁胺醇单克隆抗体溶解到60 μL、pH 5.0、0.25 mmol/L的2-（N-吗啉）乙磺酸一水合物（MES）中，向其中加入5 mg活化的磁珠，并用上述浓度MES溶液调节总体积至100 μL，轻轻混匀磁珠与沙丁胺醇单克隆抗体;室温下偶联30 min，可利用涡旋仪使磁珠保持混匀状态;离心管置于磁分离架上进行磁分离5 min，移除上清液;为了淬灭未反应的-COOH，可加入100 μL，pH 7.2～7.6的三羟甲基氨基甲烷（TRIS）反应封闭磁珠;用100 μL、0.2%BSA、0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液清洗封闭好的磁珠3～5次，将磁珠复溶于含0.3%的BSA、0.08%吐温-20/0.02%NaN5的磷酸盐缓冲液中，于2～8 ℃保藏。所述百分含量为质量百分含量。
1.3.3试剂盒对样本中沙丁胺醇的分离富集方法。
1.3.3.1取溶于偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠复溶液0.1 mL于10 mL离心管中，用5 mL去离子水润洗磁珠1～2次，将离心管在磁铁上静置2～3 min，确保磁珠全部吸附在磁铁上，每次用磁铁分离磁珠和洗液。
1.3.3.2将尿液样本5mL加入到装有润洗好的偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠的10 mL离心管中，混匀，室温下反应20 min，或者将动物组织样本用均质器均质后，称取5.0样本至样本瓶中，分别加入1.5 g氯化钠、20 mL 50%甲醇溶液，用涡旋仪涡旋5 min，室温下3 000 r/min离心5 min，吸取5 mL离心上清液，加入5mL去离子水，混匀，吸取离心上清液与去离子水的混合液5 mL与偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠混匀，在室温下反应20 min。 1.3.3.3反应完成后，用磁铁分离磁珠，用5 mL去离子水清洗磁珠，清洗2次。
1.3.3.4将1 mL甲醇加入到装有经过步骤（3）清洗过的磁珠的10 mL离心管中，混匀，静置1 min，用磁铁分离磁珠，回收甲醇溶液，用于检测分析。
1.3.4试剂盒的捕获量和回收率测定方法。
试剂盒的捕获量指每毫克偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠可以捕获沙丁胺醇的最大量。
制备沙丁胺醇浓度分别为10、15、20、25、30 ng/mL的样本溶液，每份猪尿、猪肉样本溶液为1 mL，取沙丁胺醇单克隆抗体免疫磁珠0.1mL分别加入至上述样本中，用试剂盒进行样本中沙丁胺醇的分离和富集，并用ELISA试剂盒对用偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠处理过样本进行检测。
1.3.5试剂盒的特异性测定方法。
以沙丁胺醇作为标准，设沙丁胺醇的交叉反应率为100%，用于试剂盒交叉反应性研究的药物均为与沙丁胺醇结构或者功能相似的竞争药物：克仑特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特罗、溴布特罗、特布他林、羟甲基沙丁胺醇、西马特罗、妥布特罗、马喷特罗、赛布特罗、克仑潘特、奇帕特罗、喷布特罗、克仑丙罗、马布特罗、氯丙那林。猪尿、猪肉样本中分别添加上述18种药物（包括沙丁胺醇）浓度为20 ng/mL，按照试剂盒步骤操作，对样本中沙丁胺醇进行分离富集后，利用ELISA试剂盒方法对样本进行检测。
2结果与分析
2.1试剂盒的捕获量
由表1可知，样本中沙丁胺醇浓度为10、15、20 ng/mL时，经沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒对样本中沙丁胺醇分离富集后，再经ELISA试剂盒进行检测，得出沙丁胺醇添加回收率范围为93.5%～98.5%;样本中沙丁胺醇浓度为25、30 ng/mL時，得出沙丁胺醇添加回收率范围为65.0%～76.8%，表明沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒对样品中沙丁胺醇的捕获量为20 ng/mL。
2.2特异性
从表2可以看出，试剂盒对沙丁胺醇具有较高的特异性，对与沙丁胺醇结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。
3结论与讨论
目前，在检测方法中，一般都需要对目标物进行前处理，达到分离富集的作用。较常用的前处理净化装置，包括C18柱、石墨化碳固相萃取柱、硅土固相萃取柱、硅胶SPE固相萃取柱等[11-22]。以上净化装置费用较高，不适于基层实验室大量使用。该研究的沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒价格合适，用于后期检测的灵敏度也较好。
该研究制备了抗沙丁胺醇单克隆抗体，并研发出沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒，试剂盒对样品中沙丁胺醇的捕获量为20 ng/mL，与沙丁胺醇结构或者功能相似的竞争药物：克仑特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特罗、溴布特罗、特布他林、羟甲基沙丁胺醇、西马特罗、妥布特罗、马喷特罗、赛布特罗、克仑潘特、奇帕特罗、喷布特罗、克仑丙罗、马布特罗、氯丙那林等17种药物进行特异性反应时，均无交叉反应，说明试剂盒对沙丁胺醇具有较高的特异性。
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