参照GenBank发表的序列,在金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌16S rRNA与23S rRNA之间的区域设计了3对引物,参照念珠菌和隐球菌的18S rRNA的序列设计1对引物,建立了检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法。参照Skladny的方法制备模拟了细菌感染临床标本。结果表明:本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性,多重PCR方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度为104CFU/mL,检测无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为102CFU/mL、103CFU/mL和103CFU/mL。通过对采自临床型乳腺炎(46个)和隐性乳腺炎(167个)动物共计213个乳样分别用传统细菌学培养法和多重PCR方法进行检测,多重PCR对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率(P<0.01),但该方法对无乳链球菌和停乳链球菌的检出率与培养法差异不显著(P>0.05)。