【摘 要】
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目的 研究磷酸甘油激酶(Glycerol 3-Phosphate Kinases D,GD)代谢产物MROS/EROS堆积对呼吸道Caspase调控的影响,探索Glps介导MROS和宿主细胞线粒体内源EROS诱导宿主细胞炎性
【机 构】
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宁夏大学生命科学学院,西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,宁夏银川750021
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目的 研究磷酸甘油激酶(Glycerol 3-Phosphate Kinases D,GD)代谢产物MROS/EROS堆积对呼吸道Caspase调控的影响,探索Glps介导MROS和宿主细胞线粒体内源EROS诱导宿主细胞炎性反应的作用机制. 方法 构建GD蛋白原核表达载体pET-32a-GD,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物后通过GE AKTA Pure蛋白质层析纯化系统纯化重组蛋白;通过细胞毒性试验和细胞线粒体Caspase信号通路相关试验,研究GD代谢产物MROS在上皮细胞中堆积后刺激细胞发生的一系列细胞炎性反应. 结果 实验成功构建GD蛋白表达载体,经过SDS-PAGE和Western blot验证后确定GD蛋白正确表达,进一步大量表达GD蛋白用于体外实验;在GD蛋白感染支气管上皮细胞后,实验表明,随着感染时间的延长,GD蛋白能够显著抑制支气管上皮细胞的增殖能力,感染24 h时,细胞增殖能力较对照组有显著下降(P＜0.05),同时,转录水平和蛋白水平检测证明GD蛋白感染支气管上皮细胞24 h后能刺激细胞促炎因子过量表达,TNF-α,ILs,NF-κB和IRF-3的表达与对照组相比显著上调(P＜0.05)进而激活Caspase信号通路中Caspase3的活化,导致胞内ROS的大量积累,引起细胞组织结构损伤. 结论 GD蛋白通过抑制支气管上皮细胞增殖能力,刺激胞内促炎因子的过量表达,介导胞内ROS的过表达和调控Caspase信号通路导致呼吸系统损伤.这将为进一步研究绵羊支原体肺炎致病机制及宿主免疫应答调控提供理论基础.
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