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摘要：目的：探讨与血管生成密切相关的肝癌干细胞标志CD133和CD34在二乙基亚硝胺诱导的小鼠肝癌组织中表达的变化。方法：采用二乙基亚硝胺和四氯化碳诱导C57BL/6J小鼠肝癌，于16W后处死小鼠取正常肝组织，癌旁组织和癌组织。提取总RNA并采用Real time RT-PCR（SYBR Green）法来检测肿瘤标志基因甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP），肝脏癌组织中CD133、CD34及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） mRNA的表达。结果：C57BL/6J小鼠肝癌组织中AFP表达明显升高（正常组，100±21.49；癌旁组织，161.55±38.59；癌组织，1175.79±325.47，P < 0.01）；与正常组比较（CD133，0.317±0.047；CD34， 0.067±0.007；VEGF，3.452±1.265），肝癌组织及癌旁组织中CD133、CD34和VEGF mRNA表达明显升高，尤其是癌组织（CD133，0.881±0.121；CD34，0.147±0.020；VEGF，8.274±2.621；P < 0.01）。结论：二乙基亚硝胺及四氯化碳诱导的C57BL/6J小鼠肝癌发生过程中干细胞标志CD133和CD34高表达，可能与新生血管有密切关系。
关键词：二乙基亚硝胺；肝癌；CD133；CD34；血管生成
Expression of CD133 and CD 34 in diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma in mice
Xu Shangfu1， Jin Tao1， Wen Guorong2， Lu Yuanfu1， Liu jie1， Jin Hai2 （
Department of Pharmacology/The Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education， Zunyi Guizhou 563000， China； 2. Department of Digest the Affiliated Hospital of Zun Yi Medical College/Gastroenterology Institute of Guizhou， Zunyi Guizhou 563000， China）
Abstract：
Objective To discus the expression of liver cancer stem cell markers CD133 and CD34 in diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma in mice. Methods Hepatic carcinoma in mice was induced by diethylnitrosamine and carbon tetrachloride. Normal liver， the adjacent and cancer tissues of mice were collected at 16W. Total RNA was extracted and expression of alpha fetoprotein（AFP）， CD133， CD34 and vascular endothelial growth factor（VEGF） mRNA in liver cancer tissue were detected by Real time RT-PCR. Results Expression of AFP in hepatoma tissues of C56BL/6J mouse was significantly increased（normal group， 100±21.49， adjacent tissues， 161.55±38.59， cancer tissue， 1175.79±325.47，P < 0.01 ）. Compared with the normal group（CD133，0.317±0.047；CD34， 0.067±0.007；VEGF，3.452±1.265）， the relative mRNA levels of CD133、CD34 and VEGF in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues were significantly increased， especially in cancer tissue（CD133，0.881±0.121， CD34，0.147±0.020， VEGF，8.274±2.621， P < 0.01）. Conclusion The expression of cancer stem cell markers CD133 and CD34 were obviously increased in the liver cancer tissues of C56BL/6J mouse induced by diethylnitrosamine and carbon tetrachloride， and it may be closely related with angiogenesis.
Key words：Diethylnitrosamine， Liver cancer， CD133， CD34， angiogenesis
【中图分类号】
R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】1002-3763（2014）07-0002-02 肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），简称肝细胞癌，是原发性肝癌的主要形式，是临床最常见的恶性肿瘤之一。目前我国的发病人数约占全球的半数以上，是严重影响我国人民健康和生命的一大杀手[1-2]。肿瘤的发生发展与血液供应有密切关系，传统观点认为肿瘤的血管由周围血管出牙（血管生成，angiogenesis）和内皮祖细胞的招募分化（血管发生，vasculogenesis）形成，近年来随着对肿瘤干细胞的深入研究发现，肿瘤干细胞可能是肿瘤组织血管生成的关键[3]。本文通过二乙基亚硝胺和四氯化碳诱导C57BL/6J小鼠发生肝癌，并检测肝癌组织中肿瘤干细胞CD133和CD34的表达，探讨其与原发性肝癌发生过程中血管生成的关系。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器：二乙基亚硝胺购自天津化学试剂研究所；四氯化碳购自阿拉丁化学试剂公司；提取总RNA用的Trizol购自大连宝生物公司；逆转录试剂盒购自Applied Biosystems公司；PCR用SYBR Green预混液购自BIO-RAD公司；实时荧光定量PCR仪为BIO-RAD公司产品（型号为CFX connect）；德国Eppendoff多功能梯度PCR仪等。
1.2 实验动物与分组：健康雄性C57BL/6J小鼠，体重18-22g，共24只，由重庆市第三军医大学大坪医院实验动物中心提供（SCXK（渝）2012-0001）。于遵义医学院医学与生物学研究中心SPF级动物房饲养，自由进食、饮水。适应性喂养一周后随机分为两组，正常组（12只）和肝癌组（12只）。
1.3 原发性肝癌的诱导与取材：肝癌组小鼠以100mg/kg二乙基亚硝胺腹腔注射1次；3天后以20%四氯化碳（溶于橄榄油）灌胃，灌胃剂量为0.05ml/10g，2次/周；于第3周再次以50 mg/kg二乙基亚硝胺腹腔注射1次，同时给予含有9%乙醇的饮用水；第4周开始四氯化碳剂量调整致0.08 ml/10g直至16周[4]；正常组给予灭菌普通水。16周末脱颈处死小鼠取正常肝组织，癌旁组织及癌组织。
1.4 Real time RT-PCR检测肝癌组织AFP、CD133、CD34和VEGF mRNA的表达 肝组织100mg采用Trizol抽屉总RNA，紫外分光光度计法检测总RNA的浓度和质量，以260/280的比值在1.8-2.0之间认为RNA较纯并可用于下一步实验；调整总RNA浓度为50ng/ul进行逆转录（37℃，15min；85℃，5sec），所得cDNA进行SYBR Green PCR反应（退火温度为60℃），PCR反应以beta actin作为内参照，所用特异性引物如表1；结果采用相对定量法进行分析[5]。
2 结果
2.1 肝癌组织肿瘤标志物AFP mRNA的表达：如图1显示，C57BL/6J小鼠制模后16W大体肝脏标本可见散在的大小不等的结节，肝脏表面凸凹不平。高特异性和灵敏性的原发性肝癌标志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）mRNA在癌组织中相对表达显著增高（正常组，100±21.49；癌旁组织，161.55±38.59；癌组织，1175.79±325.47），以均数计算升高11倍（P < 0.01）。
2.2 肝癌组织中CD133、CD34和VEGF mRNA的表达：结果显示（图2、3、4）二乙基亚硝胺和四氯化碳诱导的C57BL/6J小鼠肝癌组织及癌旁组织中CD133、CD34和VEGF mRNA表达明显升高（CD133，正常组0.317±0.047，癌旁组织0.641±0.098，癌组织0.881±0.121；CD34，正常组0.067±0.007，癌旁组织0.096±0.014，癌组织0.147±0.020；VEGF，正常组3.452±1.265，癌旁组织4.794±0.665，癌组织8.274±2.621），尤其在癌组织中3个基因均称现基因高表达现象（P < 0.01）。
3 讨论
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其病因和发病机制尚未确定，目前认为与肝硬化、病毒性肝炎以及黄曲霉素等化学致癌物质和环境因素有关。二乙基亚硝胺对肝脏的作用从肝细胞损伤再生到肝硬化直至癌变，与人类肝癌的发生类似，是成熟的肝癌化学诱导剂[6]。我们的实验结果可见二乙基亚硝胺、四氯化碳联合用药16周后肝脏肿瘤发生，并且特异性肝癌标志物AFP的表达在肝癌组织中显著升高，说明C57BL/6J小鼠原发性肝癌诱导成功。
随着肿瘤干细胞的研究不断深入，认为肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力，可以无限增殖和分化潜能的细胞，其具有高致瘤性，在肿瘤的发生、发展中起关键作用[2]。肝癌干细胞密切相关的表面标记物尚没有特异性标志，但主要有OV6、CD133、CD34、CD90、CD44、EpCAM、CD13等[6]。其中CD133是肝癌干细胞的重要标志分子之一，研究就发现无论是肝癌细胞系，还是肝炎后肝硬化组织、癌旁组织均有CD133抗原的表达，在肝癌细胞系中CD133阳性率可达到47%，且成瘤率非常高[7-9]。CD34特异性血管内皮细胞标志物，在肝癌组织中阳性表达率较高，而VEGF主要可通过与其受体结合参与血管形成[10-11]。文献报道肿瘤干细胞是影响血管生成的关键，也有研究认为肿瘤干细胞与血管生成拟态有关[2]。我们的研究发现，二乙基亚硝胺和四氯化碳诱导的C57BL/6J小鼠肝癌组织中CD133、CD34和VEGF 的mRNA均呈现高表达，并且CD133的表达与CD34和VEGF呈正相关，提示在实验动物原发性肝癌模型中，肿瘤干细胞与肝癌组织血管形成有密切关系。 参考文献
[1] 金涛， 文国容， 金海， 等. 二乙基亚硝胺诱导小鼠肝癌的时钟基因表达变化[J]. 成都医学院学报， 2013， 8（2）： 156 - 159.
[2] 文国容，金海， 徐尚福， 等. 小鼠原发性肝癌中胰岛素样生长因子2 和H19 的表达及意义[J]. 遵义医学院学报， 2013， 36（5）： 422 - 424.
[3] 刘晓梅， 陈忠平. 肿瘤血管生成拟态和肿瘤干细胞[J]. 中国神经肿瘤杂志， 2009， 7（4）： 275 - 278.
[4] 匡志鹏， 谢裕安， 杨帆， 等. C57BL/6J小鼠肝癌动物模型的建立[J]. 中国普通外科杂志， 2007， 16（7）： 657 - 660.
[5] Shangfu Xu， Limei Yu， Zhenhai Fan， et al. Improvement of ginsenoside Rg1 on hematopoietic function in cyclophosphamide-induced myelosuppression mice [J]. European Journal of Pharmacology， 2012； 695： 7 - 12.
[6] 单魁中， 华海清. 肝癌干细胞的研究进展[J]. 临床肿瘤学杂志， 2012， 17（3）： 271 - 276.
[7] Shengyong Yin， Jinjun Li， Chen Hu， et al. CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity [J]. Int J Cancer， 2007， 120（7）：1444 - 1450.
[8] Suetsugu A， Nagaki M， Aoki H， et al. Characterization of CD133+ hepatocellular carcinoma cells as cancer stem/progenitor cells [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 351（4）： 820 - 824.
[9] Ma S， Chan KW， Hu L， et al. Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells [J]. Gastroenterology， 2007， 132（7）： 2542 - 2556.
[10] 王李杰， 白莉， 李杰.肝细胞肝癌组织COX2和VEGF及NFκB的表达及相关性研究[J]. 中华肿瘤防治杂志， 2011， 18（9）： 693 - 696.
[11] 马捷， 周晓军， 张泰和， 等. 人肝癌组织中CD34和血管内皮生长因子的表达及微血管密度的病理意义[J]. 中华病理学杂志， 2000， 29（4）： 6 - 9.
关键词：二乙基亚硝胺；肝癌；CD133；CD34；血管生成
Expression of CD133 and CD 34 in diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma in mice
Xu Shangfu1， Jin Tao1， Wen Guorong2， Lu Yuanfu1， Liu jie1， Jin Hai2 （
Department of Pharmacology/The Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education， Zunyi Guizhou 563000， China； 2. Department of Digest the Affiliated Hospital of Zun Yi Medical College/Gastroenterology Institute of Guizhou， Zunyi Guizhou 563000， China）
Abstract：
Objective To discus the expression of liver cancer stem cell markers CD133 and CD34 in diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma in mice. Methods Hepatic carcinoma in mice was induced by diethylnitrosamine and carbon tetrachloride. Normal liver， the adjacent and cancer tissues of mice were collected at 16W. Total RNA was extracted and expression of alpha fetoprotein（AFP）， CD133， CD34 and vascular endothelial growth factor（VEGF） mRNA in liver cancer tissue were detected by Real time RT-PCR. Results Expression of AFP in hepatoma tissues of C56BL/6J mouse was significantly increased（normal group， 100±21.49， adjacent tissues， 161.55±38.59， cancer tissue， 1175.79±325.47，P < 0.01 ）. Compared with the normal group（CD133，0.317±0.047；CD34， 0.067±0.007；VEGF，3.452±1.265）， the relative mRNA levels of CD133、CD34 and VEGF in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues were significantly increased， especially in cancer tissue（CD133，0.881±0.121， CD34，0.147±0.020， VEGF，8.274±2.621， P < 0.01）. Conclusion The expression of cancer stem cell markers CD133 and CD34 were obviously increased in the liver cancer tissues of C56BL/6J mouse induced by diethylnitrosamine and carbon tetrachloride， and it may be closely related with angiogenesis.
Key words：Diethylnitrosamine， Liver cancer， CD133， CD34， angiogenesis
【中图分类号】
R735.7 【文献标识码】A 【文章编号】1002-3763（2014）07-0002-02 肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），简称肝细胞癌，是原发性肝癌的主要形式，是临床最常见的恶性肿瘤之一。目前我国的发病人数约占全球的半数以上，是严重影响我国人民健康和生命的一大杀手[1-2]。肿瘤的发生发展与血液供应有密切关系，传统观点认为肿瘤的血管由周围血管出牙（血管生成，angiogenesis）和内皮祖细胞的招募分化（血管发生，vasculogenesis）形成，近年来随着对肿瘤干细胞的深入研究发现，肿瘤干细胞可能是肿瘤组织血管生成的关键[3]。本文通过二乙基亚硝胺和四氯化碳诱导C57BL/6J小鼠发生肝癌，并检测肝癌组织中肿瘤干细胞CD133和CD34的表达，探讨其与原发性肝癌发生过程中血管生成的关系。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器：二乙基亚硝胺购自天津化学试剂研究所；四氯化碳购自阿拉丁化学试剂公司；提取总RNA用的Trizol购自大连宝生物公司；逆转录试剂盒购自Applied Biosystems公司；PCR用SYBR Green预混液购自BIO-RAD公司；实时荧光定量PCR仪为BIO-RAD公司产品（型号为CFX connect）；德国Eppendoff多功能梯度PCR仪等。
1.2 实验动物与分组：健康雄性C57BL/6J小鼠，体重18-22g，共24只，由重庆市第三军医大学大坪医院实验动物中心提供（SCXK（渝）2012-0001）。于遵义医学院医学与生物学研究中心SPF级动物房饲养，自由进食、饮水。适应性喂养一周后随机分为两组，正常组（12只）和肝癌组（12只）。
1.3 原发性肝癌的诱导与取材：肝癌组小鼠以100mg/kg二乙基亚硝胺腹腔注射1次；3天后以20%四氯化碳（溶于橄榄油）灌胃，灌胃剂量为0.05ml/10g，2次/周；于第3周再次以50 mg/kg二乙基亚硝胺腹腔注射1次，同时给予含有9%乙醇的饮用水；第4周开始四氯化碳剂量调整致0.08 ml/10g直至16周[4]；正常组给予灭菌普通水。16周末脱颈处死小鼠取正常肝组织，癌旁组织及癌组织。
1.4 Real time RT-PCR检测肝癌组织AFP、CD133、CD34和VEGF mRNA的表达 肝组织100mg采用Trizol抽屉总RNA，紫外分光光度计法检测总RNA的浓度和质量，以260/280的比值在1.8-2.0之间认为RNA较纯并可用于下一步实验；调整总RNA浓度为50ng/ul进行逆转录（37℃，15min；85℃，5sec），所得cDNA进行SYBR Green PCR反应（退火温度为60℃），PCR反应以beta actin作为内参照，所用特异性引物如表1；结果采用相对定量法进行分析[5]。
2 结果
2.1 肝癌组织肿瘤标志物AFP mRNA的表达：如图1显示，C57BL/6J小鼠制模后16W大体肝脏标本可见散在的大小不等的结节，肝脏表面凸凹不平。高特异性和灵敏性的原发性肝癌标志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）mRNA在癌组织中相对表达显著增高（正常组，100±21.49；癌旁组织，161.55±38.59；癌组织，1175.79±325.47），以均数计算升高11倍（P < 0.01）。
2.2 肝癌组织中CD133、CD34和VEGF mRNA的表达：结果显示（图2、3、4）二乙基亚硝胺和四氯化碳诱导的C57BL/6J小鼠肝癌组织及癌旁组织中CD133、CD34和VEGF mRNA表达明显升高（CD133，正常组0.317±0.047，癌旁组织0.641±0.098，癌组织0.881±0.121；CD34，正常组0.067±0.007，癌旁组织0.096±0.014，癌组织0.147±0.020；VEGF，正常组3.452±1.265，癌旁组织4.794±0.665，癌组织8.274±2.621），尤其在癌组织中3个基因均称现基因高表达现象（P < 0.01）。
3 讨论
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其病因和发病机制尚未确定，目前认为与肝硬化、病毒性肝炎以及黄曲霉素等化学致癌物质和环境因素有关。二乙基亚硝胺对肝脏的作用从肝细胞损伤再生到肝硬化直至癌变，与人类肝癌的发生类似，是成熟的肝癌化学诱导剂[6]。我们的实验结果可见二乙基亚硝胺、四氯化碳联合用药16周后肝脏肿瘤发生，并且特异性肝癌标志物AFP的表达在肝癌组织中显著升高，说明C57BL/6J小鼠原发性肝癌诱导成功。
随着肿瘤干细胞的研究不断深入，认为肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力，可以无限增殖和分化潜能的细胞，其具有高致瘤性，在肿瘤的发生、发展中起关键作用[2]。肝癌干细胞密切相关的表面标记物尚没有特异性标志，但主要有OV6、CD133、CD34、CD90、CD44、EpCAM、CD13等[6]。其中CD133是肝癌干细胞的重要标志分子之一，研究就发现无论是肝癌细胞系，还是肝炎后肝硬化组织、癌旁组织均有CD133抗原的表达，在肝癌细胞系中CD133阳性率可达到47%，且成瘤率非常高[7-9]。CD34特异性血管内皮细胞标志物，在肝癌组织中阳性表达率较高，而VEGF主要可通过与其受体结合参与血管形成[10-11]。文献报道肿瘤干细胞是影响血管生成的关键，也有研究认为肿瘤干细胞与血管生成拟态有关[2]。我们的研究发现，二乙基亚硝胺和四氯化碳诱导的C57BL/6J小鼠肝癌组织中CD133、CD34和VEGF 的mRNA均呈现高表达，并且CD133的表达与CD34和VEGF呈正相关，提示在实验动物原发性肝癌模型中，肿瘤干细胞与肝癌组织血管形成有密切关系。 参考文献
[1] 金涛， 文国容， 金海， 等. 二乙基亚硝胺诱导小鼠肝癌的时钟基因表达变化[J]. 成都医学院学报， 2013， 8（2）： 156 - 159.
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[6] 单魁中， 华海清. 肝癌干细胞的研究进展[J]. 临床肿瘤学杂志， 2012， 17（3）： 271 - 276.
[7] Shengyong Yin， Jinjun Li， Chen Hu， et al. CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity [J]. Int J Cancer， 2007， 120（7）：1444 - 1450.
[8] Suetsugu A， Nagaki M， Aoki H， et al. Characterization of CD133+ hepatocellular carcinoma cells as cancer stem/progenitor cells [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 351（4）： 820 - 824.
[9] Ma S， Chan KW， Hu L， et al. Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells [J]. Gastroenterology， 2007， 132（7）： 2542 - 2556.
[10] 王李杰， 白莉， 李杰.肝细胞肝癌组织COX2和VEGF及NFκB的表达及相关性研究[J]. 中华肿瘤防治杂志， 2011， 18（9）： 693 - 696.
[11] 马捷， 周晓军， 张泰和， 等. 人肝癌组织中CD34和血管内皮生长因子的表达及微血管密度的病理意义[J]. 中华病理学杂志， 2000， 29（4）： 6 - 9.