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摘要：本实验以铁皮石斛愈伤组织为研究材料。具体研究了不同的基本培养基、蔗糖浓度、香蕉提取物浓度及NAA浓度的变化等对铁皮石斛原球茎增殖及多糖含量累积的影响。研究结果表明：适中的无机盐浓度，NAA、适量椰子汁的浓度都有利于铁皮石斛愈伤组织的增殖生长；无机盐、NAA浓度的变化对多糖含量的累积变化不大，而椰子汁的浓度变化对多糖含量的变化影响较大。
关键词：铁皮石斛；愈伤组织；原球茎；悬浮培养
中图分类号：S567.239 文献标识码：A 文章编号：1674—0432（2012）—08—0046—2
基金项目：贵州省科技创新人才团队建设项目（黔科合人才团队[2009]4007号）；贵州省青年教师基金，黔科合J字LKS[2010]16号
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）珍稀濒危植物，传统名贵中药材，是石斛中的上品，具有抗衰老、抗肿瘤、滋阴清热、滋阴养胃、清热生津、润肺止咳之功效，扩张血管及抗血小板凝集等作用[3—5]。主要分布于我国云南、贵州、广西、台湾等地。铁皮石斛生长在年平均气温12℃～18℃、相对湿度60%～75%、林间透光度60%、无霜多雾、年降雨1100～1500mm的常绿阔叶林的树干上以及少数石灰岩上[1—2]。自然条件下，野生铁皮石斛种子通过风媒和虫媒传播，其成活率极低，从种子萌发到进入商品阶段要经过5～7年时间，生长缓慢，而且人们过度采挖，导致铁皮石斛资源日益枯竭[7]。铁皮石斛是珍稀名贵的中草药，由于市场需求过大，人们对野生石斛的过度采挖，致使我国的野生石斛资源遭到严重的破坏，野生石斛属植物资源已近濒危，为加强石斛的资源保护，建立无性系快速繁殖系统，提高培养材料的繁殖系数，实现大力发展药用石斛产业，从试管苗到大田栽培的中间环节成为制约铁皮石斛大面积人工栽培的主要障碍[8]，铁皮石斛已被列为濒危物种[4] 。为了缓解供求矛盾，研究者开始探索人工繁殖的方法。目前，铁皮石斛的繁殖方法大多为常规的固体培养[6]，有播种量小、周期长、劳动力消耗大、成本高等缺点，而液体悬浮培养可有效地解决这一问题，试验将对影响铁皮石斛种子液体培养的营养因子进行研究，以期为铁皮石斛的繁殖开发利用提供理论依据。本实验重点研究铁皮石斛原胚体高效诱导、增殖及多糖累积的影响，对于实现铁皮石斛的批量化生产具有一定的指导作用。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo），由贵州师范大学生命科学院生物化学与分子生物学重点实验室提供。
1.2 培养基及基本培养条件
试验采用的基本培养基为1/2MS固体培养基，蔗糖3%，pH5.8，培养条件：温度（25±2）℃，光照l2h/d，光照强度为120μmol·m—2·s—1 。
1.3 试验方法
1.3.1 原胚体诱导
将成熟未裂开的蒴果先用75%的酒精表面消毒30s，再用3%NaClO的消毒15min，无菌水冲洗5次。将蒴果切开，将种子接种于1/2MS的固体培养基中进行培养，在固体培养基中加入NAA0.3～0.5（mg/L 单位下同），培养40d后种子萌发为原胚体。
1.3.2 原胚体增殖试验
基本培养基为：以MS、1/2MS、B5、1/2B5、为基本培养基，均附加6—BA1.0+NAA0.2+3%（蔗糖）；蔗糖浓度为：以1/2MS+6—BA1.0+NAA0.2，分别附加0、1%、2%、3%的蔗糖；激素NAA浓度为：以1/2B5+6—BA1.0+3%蔗糖，分别附加NAA 0、O.2、0.5、1.0；椰子汁浓度为：以1/2B5+6—BA1.0+NAA0.2+3%蔗糖，分别附加椰子汁0、10%、20%、30%。以上试验均重复3次，30d后统计数据。
1.3.3 可溶性多糖含量的测定
1.3.3.1 标准曲线的制作 配制100ug/mL蔗糖标准溶液，分别取0，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL；加蒸馏水定容至lmL；测量620nm波长下的吸光度.以标准蔗糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=0.0048x+0.0065，R2=0.9926。
1.3.3.2 可溶性多糖的提取 将铁皮石斛原胚体于80℃烘干至恒重，称取0.2g，研磨。溶于20mL蒸馏水，煮沸20min，过滤。上清液加入2mL醋酸铅溶液去蛋白，再加入0.2g草酸钾沉淀多余的醋酸铅，再过滤，滤液定容至100mL，制得可溶性多糖提取液[9]。取lmL提取液，加入5mL蒽酮溶液，煮沸5min，迅速用冰水冷却，制得样品供分析用。使用7220型紫外分光光度计在620nm波长下测量其吸光度值。
1.3.3.3 增殖系数 增殖率=（培养后重量—接种后重量）/接种量。
1.3.3.4 原胚体生长倍数 原胚体生长倍数= 培养后重量/接种时重量。
2 实验结果与分析
2.1 无机盐对铁皮石斛原胚体增殖的影响
增殖系数=（培养后重量—接种量）/接种量
从表1可以看出，无机盐浓度对铁皮石斛原胚体的增殖影响明显。MS培养基无机盐浓度过高，不利于原胚体的增值，1/2 B5培养基上增殖系数最高为1.454；MS培养基上增值率最低，说明铁皮石斛原胚体的增殖需要合适的无机盐浓度，并非越高越好；而多糖的累积却需要较低的无机盐浓度。
2.2 蔗糖浓度对铁皮石斛原胚体增殖的影响
蔗糖是基础培养基的组成物质，是植物细胞生长必需的碳源。对原胚体的增殖具有重大影响，不同浓度的蔗糖处理，蔗糖浓度对原胚体增殖存在显著差异。由表2可知，蔗糖浓度对铁皮石斛原胚体的增殖影响明显，在一定的浓度范围内，随着蔗糖浓度的升高，铁皮石斛原球茎的增殖也随之升高，当蔗糖浓度为3%时，增殖系数最高为1.30，作为多糖合成的底物，随着蔗糖浓度的升高，原胚体的多糖含量也增高。但蔗糖除作为碳源外，还起到调节培养基渗透压的作用。因此，蔗糖浓度过高，培养基渗透压提高，影响了原胚体的正常生长，其增殖系数和多糖的累积量也会受到影响。 2.3 NAA浓度对铁皮石斛愈伤组织增殖的影响
NAA系植物生长素类物质，它是影响细胞状态的重要调控因子。由表3可知，添加NAA对原胚体的增殖有明显效果。在一定范围内随着NAA浓度的升高，原球茎的增殖迅速，当NAA浓度为0.5mg/L时，增殖系数最高，达到3.66。随着NAA浓度的进一步提高到1mg/L时，原球茎的增殖率开始降低，而多糖物质的积累随原胚体的迅速增殖而下降。结果表明，NAA浓度为0.5mg/L时，原球茎的增殖率最高，且多糖累积含量也相对较高。
2.4 椰子汁对铁皮石斛原胚体增殖的影响
人们早就认识到水解酪蛋白、酵母提取物、苹果汁等有机附加物有利于离体培养植物组织和细胞的生长。椰子汁浓度不同，铁皮石斛增殖效果也不同，从表4可以看出，天然附加物椰子汁对铁皮石斛的增殖影响不是很显著，但对铁皮石斛的生长具有一定的帮助。用浓度为20%的椰子汁处理的铁皮石斛原胚体，无论增殖率还是植株的长势效果均是最好。当继续增加香蕉汁的浓度时，铁皮石斛原球茎的增殖开始下降，多糖的累积量随着原球茎的生长也开始降低，可能是由于香蕉汁的浓度加大使得培养基的硬度加大，从而影响原胚体的生长，具体原因有待于进一步研究。
3 结果与分析
本试验以铁皮石斛原胚体为材料，对铁皮石斛原胚体的增殖及多糖含量的累积进行了研究。试验结果表明：铁皮石斛在B5培养基+0.5mg∕L NAA，蔗糖浓度为3%，20%椰子汁培养基中效果最佳，可溶性多糖成分累积相对较高。
铁皮石斛原胚体的诱导和增殖是其离体培养中的重要环节。本文对基本培养基、植物生长调节剂浓度、天然附加物等因素进行了研究，结果表明，基本培养基以1/2B5的增殖率最高且效果最好，明显优于MS、1/2MS。NAA对植物愈伤组织的增殖影响更大，适中和较低浓度的NAA比较有利于铁皮石斛原胚体的增殖生长。蔗糖是植物细胞生长必需的碳源，在一定的浓度范围内，随着蔗糖浓度的升高，铁皮石斛原胚体的增殖也随之升高，当蔗糖浓度为3%时，增殖系数最高为1.30，作为多糖合成的底物，随着蔗糖浓度的升高，原胚体的多糖含量也增高。但蔗糖除作为碳源外，还起到调节培养基渗透压的作用[10]。因此，蔗糖浓度过高，培养基渗透压提高，影响了原胚体的正常生长，其增殖系数和多糖的累积量也会受到影响。天然附加物椰子汁在试验中不是必须的，但众多实验和研究表明，特别是在植物组织培养中加入天然附加物的确能促进植物增殖生长，使试验效果更优，从而被广泛运用于试验中。在一定范围内增加椰子汁的浓度时，无论增殖率还是植株的长势效果均为最好，当继续增加椰子汁的浓度时，铁皮石斛原胚体的增殖开始下降，多糖的累积量随着原球茎的生长也开始降低，这可能是由于香蕉汁的浓度加大使得培养基的硬度加大，从而影响原胚体的生长，具体原因有待于进一步研究。
参考文献
[1] 包雪声，顺庆生，陈立钻.中国药用石斛彩色图谱[M].上海：上海医科大学出版社，2001.
[2] 中国科学院植物研究所. 中国高等植物：第13卷[M].青岛：青岛出版社，2002，678.
[3] 刘青林，马祎，郑玉梅.花卉组织培养[M.北京：中国农业出版社，2003：47.
[4] 邵华，张玲琪，李俊梅，等.铁皮石斛研究进展[J].中草药，2004，35（1）：109—111.
[5] 蒋波，杨存亮，黄捷，等.铁皮石斛原球茎生长分化及生根壮苗研究[J].玉林师范学院学报：自然科学版，2005，（3）：66—69.
[6] 宋经元，郭顺星，肖培根.铁皮石斛原球茎液体培养的研究[J].中草药2004，（9）：1042—1046.
[7] 奕军.现代实验设计优化方法[M].上海：上海交通大学出版社，1995：54.
[8] 王永，史俊.园艺植物组织培养[M].北京：中国农业出版社，2010.
[9] 何铁光，杨丽涛，等.铁皮石斛原球茎多糖提取最佳工艺研究[J].西北农业学报， 2006，15（5）：240—243.
[10] 侯丕勇，郭顺星.悬浮培养的铁皮石斛原球茎在固体培养基上生长和分化的研究[J].中国中药杂志，2000，（10）：729—732.
作者简介：张宇斌（1978—），贵州江口人，贵州师范大学生命科学学院硕士研究生，从事植物资源、植物生理生态的研究。
关键词：铁皮石斛；愈伤组织；原球茎；悬浮培养
中图分类号：S567.239 文献标识码：A 文章编号：1674—0432（2012）—08—0046—2
基金项目：贵州省科技创新人才团队建设项目（黔科合人才团队[2009]4007号）；贵州省青年教师基金，黔科合J字LKS[2010]16号
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）珍稀濒危植物，传统名贵中药材，是石斛中的上品，具有抗衰老、抗肿瘤、滋阴清热、滋阴养胃、清热生津、润肺止咳之功效，扩张血管及抗血小板凝集等作用[3—5]。主要分布于我国云南、贵州、广西、台湾等地。铁皮石斛生长在年平均气温12℃～18℃、相对湿度60%～75%、林间透光度60%、无霜多雾、年降雨1100～1500mm的常绿阔叶林的树干上以及少数石灰岩上[1—2]。自然条件下，野生铁皮石斛种子通过风媒和虫媒传播，其成活率极低，从种子萌发到进入商品阶段要经过5～7年时间，生长缓慢，而且人们过度采挖，导致铁皮石斛资源日益枯竭[7]。铁皮石斛是珍稀名贵的中草药，由于市场需求过大，人们对野生石斛的过度采挖，致使我国的野生石斛资源遭到严重的破坏，野生石斛属植物资源已近濒危，为加强石斛的资源保护，建立无性系快速繁殖系统，提高培养材料的繁殖系数，实现大力发展药用石斛产业，从试管苗到大田栽培的中间环节成为制约铁皮石斛大面积人工栽培的主要障碍[8]，铁皮石斛已被列为濒危物种[4] 。为了缓解供求矛盾，研究者开始探索人工繁殖的方法。目前，铁皮石斛的繁殖方法大多为常规的固体培养[6]，有播种量小、周期长、劳动力消耗大、成本高等缺点，而液体悬浮培养可有效地解决这一问题，试验将对影响铁皮石斛种子液体培养的营养因子进行研究，以期为铁皮石斛的繁殖开发利用提供理论依据。本实验重点研究铁皮石斛原胚体高效诱导、增殖及多糖累积的影响，对于实现铁皮石斛的批量化生产具有一定的指导作用。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo），由贵州师范大学生命科学院生物化学与分子生物学重点实验室提供。
1.2 培养基及基本培养条件
试验采用的基本培养基为1/2MS固体培养基，蔗糖3%，pH5.8，培养条件：温度（25±2）℃，光照l2h/d，光照强度为120μmol·m—2·s—1 。
1.3 试验方法
1.3.1 原胚体诱导
将成熟未裂开的蒴果先用75%的酒精表面消毒30s，再用3%NaClO的消毒15min，无菌水冲洗5次。将蒴果切开，将种子接种于1/2MS的固体培养基中进行培养，在固体培养基中加入NAA0.3～0.5（mg/L 单位下同），培养40d后种子萌发为原胚体。
1.3.2 原胚体增殖试验
基本培养基为：以MS、1/2MS、B5、1/2B5、为基本培养基，均附加6—BA1.0+NAA0.2+3%（蔗糖）；蔗糖浓度为：以1/2MS+6—BA1.0+NAA0.2，分别附加0、1%、2%、3%的蔗糖；激素NAA浓度为：以1/2B5+6—BA1.0+3%蔗糖，分别附加NAA 0、O.2、0.5、1.0；椰子汁浓度为：以1/2B5+6—BA1.0+NAA0.2+3%蔗糖，分别附加椰子汁0、10%、20%、30%。以上试验均重复3次，30d后统计数据。
1.3.3 可溶性多糖含量的测定
1.3.3.1 标准曲线的制作 配制100ug/mL蔗糖标准溶液，分别取0，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL；加蒸馏水定容至lmL；测量620nm波长下的吸光度.以标准蔗糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=0.0048x+0.0065，R2=0.9926。
1.3.3.2 可溶性多糖的提取 将铁皮石斛原胚体于80℃烘干至恒重，称取0.2g，研磨。溶于20mL蒸馏水，煮沸20min，过滤。上清液加入2mL醋酸铅溶液去蛋白，再加入0.2g草酸钾沉淀多余的醋酸铅，再过滤，滤液定容至100mL，制得可溶性多糖提取液[9]。取lmL提取液，加入5mL蒽酮溶液，煮沸5min，迅速用冰水冷却，制得样品供分析用。使用7220型紫外分光光度计在620nm波长下测量其吸光度值。
1.3.3.3 增殖系数 增殖率=（培养后重量—接种后重量）/接种量。
1.3.3.4 原胚体生长倍数 原胚体生长倍数= 培养后重量/接种时重量。
2 实验结果与分析
2.1 无机盐对铁皮石斛原胚体增殖的影响
增殖系数=（培养后重量—接种量）/接种量
从表1可以看出，无机盐浓度对铁皮石斛原胚体的增殖影响明显。MS培养基无机盐浓度过高，不利于原胚体的增值，1/2 B5培养基上增殖系数最高为1.454；MS培养基上增值率最低，说明铁皮石斛原胚体的增殖需要合适的无机盐浓度，并非越高越好；而多糖的累积却需要较低的无机盐浓度。
2.2 蔗糖浓度对铁皮石斛原胚体增殖的影响
蔗糖是基础培养基的组成物质，是植物细胞生长必需的碳源。对原胚体的增殖具有重大影响，不同浓度的蔗糖处理，蔗糖浓度对原胚体增殖存在显著差异。由表2可知，蔗糖浓度对铁皮石斛原胚体的增殖影响明显，在一定的浓度范围内，随着蔗糖浓度的升高，铁皮石斛原球茎的增殖也随之升高，当蔗糖浓度为3%时，增殖系数最高为1.30，作为多糖合成的底物，随着蔗糖浓度的升高，原胚体的多糖含量也增高。但蔗糖除作为碳源外，还起到调节培养基渗透压的作用。因此，蔗糖浓度过高，培养基渗透压提高，影响了原胚体的正常生长，其增殖系数和多糖的累积量也会受到影响。 2.3 NAA浓度对铁皮石斛愈伤组织增殖的影响
NAA系植物生长素类物质，它是影响细胞状态的重要调控因子。由表3可知，添加NAA对原胚体的增殖有明显效果。在一定范围内随着NAA浓度的升高，原球茎的增殖迅速，当NAA浓度为0.5mg/L时，增殖系数最高，达到3.66。随着NAA浓度的进一步提高到1mg/L时，原球茎的增殖率开始降低，而多糖物质的积累随原胚体的迅速增殖而下降。结果表明，NAA浓度为0.5mg/L时，原球茎的增殖率最高，且多糖累积含量也相对较高。
2.4 椰子汁对铁皮石斛原胚体增殖的影响
人们早就认识到水解酪蛋白、酵母提取物、苹果汁等有机附加物有利于离体培养植物组织和细胞的生长。椰子汁浓度不同，铁皮石斛增殖效果也不同，从表4可以看出，天然附加物椰子汁对铁皮石斛的增殖影响不是很显著，但对铁皮石斛的生长具有一定的帮助。用浓度为20%的椰子汁处理的铁皮石斛原胚体，无论增殖率还是植株的长势效果均是最好。当继续增加香蕉汁的浓度时，铁皮石斛原球茎的增殖开始下降，多糖的累积量随着原球茎的生长也开始降低，可能是由于香蕉汁的浓度加大使得培养基的硬度加大，从而影响原胚体的生长，具体原因有待于进一步研究。
3 结果与分析
本试验以铁皮石斛原胚体为材料，对铁皮石斛原胚体的增殖及多糖含量的累积进行了研究。试验结果表明：铁皮石斛在B5培养基+0.5mg∕L NAA，蔗糖浓度为3%，20%椰子汁培养基中效果最佳，可溶性多糖成分累积相对较高。
铁皮石斛原胚体的诱导和增殖是其离体培养中的重要环节。本文对基本培养基、植物生长调节剂浓度、天然附加物等因素进行了研究，结果表明，基本培养基以1/2B5的增殖率最高且效果最好，明显优于MS、1/2MS。NAA对植物愈伤组织的增殖影响更大，适中和较低浓度的NAA比较有利于铁皮石斛原胚体的增殖生长。蔗糖是植物细胞生长必需的碳源，在一定的浓度范围内，随着蔗糖浓度的升高，铁皮石斛原胚体的增殖也随之升高，当蔗糖浓度为3%时，增殖系数最高为1.30，作为多糖合成的底物，随着蔗糖浓度的升高，原胚体的多糖含量也增高。但蔗糖除作为碳源外，还起到调节培养基渗透压的作用[10]。因此，蔗糖浓度过高，培养基渗透压提高，影响了原胚体的正常生长，其增殖系数和多糖的累积量也会受到影响。天然附加物椰子汁在试验中不是必须的，但众多实验和研究表明，特别是在植物组织培养中加入天然附加物的确能促进植物增殖生长，使试验效果更优，从而被广泛运用于试验中。在一定范围内增加椰子汁的浓度时，无论增殖率还是植株的长势效果均为最好，当继续增加椰子汁的浓度时，铁皮石斛原胚体的增殖开始下降，多糖的累积量随着原球茎的生长也开始降低，这可能是由于香蕉汁的浓度加大使得培养基的硬度加大，从而影响原胚体的生长，具体原因有待于进一步研究。
参考文献
[1] 包雪声，顺庆生，陈立钻.中国药用石斛彩色图谱[M].上海：上海医科大学出版社，2001.
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[3] 刘青林，马祎，郑玉梅.花卉组织培养[M.北京：中国农业出版社，2003：47.
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[6] 宋经元，郭顺星，肖培根.铁皮石斛原球茎液体培养的研究[J].中草药2004，（9）：1042—1046.
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[9] 何铁光，杨丽涛，等.铁皮石斛原球茎多糖提取最佳工艺研究[J].西北农业学报， 2006，15（5）：240—243.
[10] 侯丕勇，郭顺星.悬浮培养的铁皮石斛原球茎在固体培养基上生长和分化的研究[J].中国中药杂志，2000，（10）：729—732.
作者简介：张宇斌（1978—），贵州江口人，贵州师范大学生命科学学院硕士研究生，从事植物资源、植物生理生态的研究。