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摘要[目的] 研究制备乳酪蛋白肽的最佳工艺。 [方法]以乳酪蛋白为原料，以水解度为考察指标，確定碱性蛋白酶为乳酪蛋白的最佳水解酶。利用单因素试验考察酶解温度、 pH、投酶量、酶解时间和底物浓度对水解度的影响，确定主要影响因素。通过 L9（34） 正交试验获得碱性蛋白酶的最佳水解条件。利用凝胶色谱法确定乳酪蛋白肽的分子量。[结果]试验得出制备乳酪蛋白肽的最佳工艺为：酶解温度 60 ℃，pH 7.0，投酶量 1.5%，酶解时间 150 min。制备的乳酪蛋白肽分子量为 2 kD。 [结论]研究可为乳酪蛋白活性肽的产业化研发提供理论依据。
关键词乳酪蛋白；乳酪蛋白肽；水解度；正交试验；分子量
中图分类号S879.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-358-03
Abstract [Objective] This paper studied the best preparation process for preparing casein peptides using casein as experimental material.[Method] Alcalase was the optimal enzyme with hydrolysis degree as evaluation indexes.In single factor experiment， hydrolysis temperature， pH value， enzyme concentration， hydrolysis time and substrate concentration were selected to detect the main influence factors.The optimal hydrolysis conditions of alcalase were obtained from the results of L9（34） orthogonal test.The molecular weight of casein peptides were obtained from the results of gel permeation chromatography.[Result] The optimal hydrolysis conditions were obtained as hydrolysis temperature 60 ℃， pH 7.0， enzyme concentration 1.5% and hydrolysis time 150 min through orthogonal test analysis.Casein peptides showed molecular weight of 2 kD.[Conclusion] This paper will provide important theoretical basis and technical approach for casein peptides research and development.
Key words Casein； Casein peptides； Hydrolysis degree； Orthogonal test； Molecular weight
乳酪蛋白是一种重要的蛋白质，富含人体所需的氨基酸，是科研工作者研究的热点，在我国已形成一定规模的产业集群[1]。乳酪蛋白的氨基酸序列中潜伏着百余种活性多肽，这些活性多肽具有免疫调节、自由基清除、矿物质载体、抗癌、抗菌、降血压、溶栓等功能特征，在功能食品和药品等领域具有广泛的应用前景[2-7]。然而，这些活性多肽在乳酪蛋白氨基酸序列中不具备活性功能，只有在特异性蛋白酶的酶解过程中，才能从乳酪蛋白序列中释放出来，并发挥其生物功能。因此，笔者利用碱性蛋白酶酶解法制备乳酪蛋白肽，为乳酪蛋白及其衍生物的高附加值开发提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料原料及试剂：乳酪蛋白，青海凯兴干酪素有限公司；碱性蛋白酶（105 U/g）、中性蛋白酶 （105 U/g）、胰蛋白酶 （105 U/g），南宁庞博生物工程有限公司；糜蛋白酶 （105 U/g），上海林叶生物科技有限公司；盐酸、氢氧化钠，广西西陇化工股份有限公司；SuperdexTM Peptide 10/300 GL 凝胶色谱柱，美国 GE 公司；蛋白质标准样品，美国 Sigma 公司。
主要仪器：电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；凯氏定氮仪，福斯赛诺分析仪器有限公司；SG2 便携式 pH 计，梅特勒-托利多仪器有限公司；水浴恒温振荡器，太仓市华利达实验设备有限公司；HHS4 数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；MilliQ 超纯水纯化系统，美国 millipore 公司；AKTA 全自动蛋白层析系统，美国 GE 公司；RC6 PULS大型高速冷冻离心机，美国 Thermo Fisher Scientific；Epsilon 26D 冻干机，德国 Christ 公司。
1.2方法
1.2.1乳酪蛋白肽制备方法。取一定量的乳酪蛋白，加入 200 ml 纯水，在 85 ℃ 的恒温条件下加热预处理15 min，冷却到适当的温度，调整 pH，加入一定量的蛋白酶，水解一段时间，水解过程中保持pH不变，反应结束后，升温至 85 ℃ 灭酶 10 min。酶解液冷却离心，取上清液冷冻干燥后冷藏备用。
1.2.2水解酶的选择。以水解度为考察指标，按“1.2.1”的酶解方法，考察碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的酶解能力，确定酶解乳酪蛋白的最佳水解酶，蛋白酶的酶解条件如表 1 所示。
1.2.3单因素试验。取上述水解酶酶解乳酪蛋白，以水解度为考察指标，考察不同酶解温度、pH、酶解时间、加酶量、底物浓度对酶解效率的影响，初步确定该酶的酶解条件。 1.2.4正交试验。在单因素试验的基础上，根据正交试验的中心组合试验设计原理，进行 L9（34） 正交试验设计，以水解度为考察指标，确定优先酶的最佳酶解条件。
1.2.5水解度（DH）的测定。水解度的测定采用 pHstat 法[8-9]，根据水解过程中消耗的氢氧化钠的量计算水解度：
DH = （B×Nb）/（α×Mp×htot）
式中，B，水解中消耗氢氧化钠的体积 （L）；Nb，所用氢氧化钠的物质的量浓度 （mol/L）；α，α氨基的解离度；Mp，底物蛋白质总量（g） ；htot，毎克底物蛋白质中肽键的克当量（mol/g），乳酪蛋白的 htot为 8.2。
1.2.6分子量的测定。采用凝胶色谱法检测产品的分子量，检测条件为：色谱柱：SuperdexTM 200 10/300 GL；流动相：0.05 mol/L 磷酸缓冲盐缓冲液；流速：0.5 ml/min；检测波长：215 nm。标准蛋白分子量分别为 cytochrome C （12 384 D）、aprotinin （6 512 D）、vitamin B12（1 855 D）、（Gly）3 （189 D）、gly （75 D）。
1.2.7数据处理。所有数据均重复3次，采用 Sigmaplot 软件对试验数据进行统计学分析。
2结果与分析
2.1乳酪蛋白水解酶的确定根据表 1中的蛋白酶的水解条件可以得出，4种蛋白酶对乳酪蛋白的酶解效果各不相同，碱性蛋白酶水解乳酪蛋白时水解度最高，为（21.71±0.15）%；糜蛋白酶水解乳酪蛋白时水解度最低，为（15.03±0.08）%；而中性蛋白酶和胰蛋白酶水解乳酪蛋白时的水解度分别为（19.21±0.27）%、（17.45±0.24）%。因此筛选出碱性蛋白酶为水解乳酪蛋白的最佳蛋白酶。
2.2碱性蛋白酶水解乳酪蛋白的单因素试验
2.2.1酶解温度的影响。在酶添加量为 3%，底物浓度为 4%，pH为 9.0，酶解时间为 240 min 的条件下，考察反应温度为 30、40、50、60、70 ℃ 对水解度的影响。由图 1 可知，开始阶段，水解度随着温度的增加而大幅上升；当温度达到 60 ℃ 时，水解度达到最高；当温度大于 60 ℃ 时，随着温度的增加，水解度反而下降，这是因为温度过高，部分乳酪蛋白肽被降解成氨基酸。因此，选择酶解温度为 60 ℃ 。
2.4乳酪蛋白肽的分子量利用凝胶色谱 SuperdexTM peptide 10/300 GL 检测乳酪蛋白肽的分子量，5 种标准样品的分子量如图 6 所示，以各标准样品分子量的对数值对洗脱体积做标准曲线，得到的回归方程为 lgMr = -0.229 3V+6.375 8（R2=0.992 1）。式中，Mr 为分子量，V 为洗脱体积。通过乳酪蛋白肽的洗脱体积（图7）计算试验制备的乳酪蛋白肽的分子量为 2 kD。参考文献
[1] 汪玉松， 邹思湘.乳生物化学[M].长春： 吉林大学出版社， 1995.
[2] EBNER J，ASCI ARSLAN A，FEDOROVA M，et al.Peptide profiling of bovine kefir reveals 236 unique peptides released from caseins during its production by starter culture or kefir grains[J].Journal of proteomics， 2015， 117： 41-57.、
[3] TANG W T，YUAN H N，ZHANG H，et al.An antimicrobial peptide screened from casein hydrolyzate by Saccharomyces cerevisiae cell membrane affinity method[J].Food control， 2015， 50： 413-422.
[4] CARCATEJEDOR A，SNCHEZRIVERA L，RECIO I，et al.Dairy Debaryomyces hansenii strains produce the antihypertensive caseinderived peptides LHLPLP and HLPLP[J].LWTfood science and technology， 2015， 61： 550-556.
[5] NONGONIERMA A B，FITZGERALD R J.Inhibition of dipeptidyl peptidase IV （DPPIV） by proline containing caseinderived peptides[J].Journal of functional foods， 2013， 5： 1909-1917.
[6] SU R X，LIANG M，QI W，et al.Pancreatic hydrolysis of bovine casein： Peptide release and timedependent reaction behavior[J].Food chemistry， 2012， 133： 851-858.
[7] 陳东平，牟光庆.不同分子量酪蛋白肽对自由基清除作用研究[J].中国酿造， 2010（4）：33-35.
[8] BOUGATEF A，NEDJARARROUME N，RAVALLECPL，R et al.Angiotensin Ιconverting enzyme （ACE） inhibitory activities of sardinelle （Sardinella aurita） byproducts protein hydrolysates obtained by treatment with microbial and visceral fish serine proteases[J].Food chemistry， 2008， 111： 350-356.
[9] 胡新颖.山核桃蛋白多肽制备方法的研究[D].长春： 吉林农业大学，2002.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（26）：364-365，372
关键词乳酪蛋白；乳酪蛋白肽；水解度；正交试验；分子量
中图分类号S879.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-358-03
Abstract [Objective] This paper studied the best preparation process for preparing casein peptides using casein as experimental material.[Method] Alcalase was the optimal enzyme with hydrolysis degree as evaluation indexes.In single factor experiment， hydrolysis temperature， pH value， enzyme concentration， hydrolysis time and substrate concentration were selected to detect the main influence factors.The optimal hydrolysis conditions of alcalase were obtained from the results of L9（34） orthogonal test.The molecular weight of casein peptides were obtained from the results of gel permeation chromatography.[Result] The optimal hydrolysis conditions were obtained as hydrolysis temperature 60 ℃， pH 7.0， enzyme concentration 1.5% and hydrolysis time 150 min through orthogonal test analysis.Casein peptides showed molecular weight of 2 kD.[Conclusion] This paper will provide important theoretical basis and technical approach for casein peptides research and development.
Key words Casein； Casein peptides； Hydrolysis degree； Orthogonal test； Molecular weight
乳酪蛋白是一种重要的蛋白质，富含人体所需的氨基酸，是科研工作者研究的热点，在我国已形成一定规模的产业集群[1]。乳酪蛋白的氨基酸序列中潜伏着百余种活性多肽，这些活性多肽具有免疫调节、自由基清除、矿物质载体、抗癌、抗菌、降血压、溶栓等功能特征，在功能食品和药品等领域具有广泛的应用前景[2-7]。然而，这些活性多肽在乳酪蛋白氨基酸序列中不具备活性功能，只有在特异性蛋白酶的酶解过程中，才能从乳酪蛋白序列中释放出来，并发挥其生物功能。因此，笔者利用碱性蛋白酶酶解法制备乳酪蛋白肽，为乳酪蛋白及其衍生物的高附加值开发提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料原料及试剂：乳酪蛋白，青海凯兴干酪素有限公司；碱性蛋白酶（105 U/g）、中性蛋白酶 （105 U/g）、胰蛋白酶 （105 U/g），南宁庞博生物工程有限公司；糜蛋白酶 （105 U/g），上海林叶生物科技有限公司；盐酸、氢氧化钠，广西西陇化工股份有限公司；SuperdexTM Peptide 10/300 GL 凝胶色谱柱，美国 GE 公司；蛋白质标准样品，美国 Sigma 公司。
主要仪器：电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；凯氏定氮仪，福斯赛诺分析仪器有限公司；SG2 便携式 pH 计，梅特勒-托利多仪器有限公司；水浴恒温振荡器，太仓市华利达实验设备有限公司；HHS4 数显恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；MilliQ 超纯水纯化系统，美国 millipore 公司；AKTA 全自动蛋白层析系统，美国 GE 公司；RC6 PULS大型高速冷冻离心机，美国 Thermo Fisher Scientific；Epsilon 26D 冻干机，德国 Christ 公司。
1.2方法
1.2.1乳酪蛋白肽制备方法。取一定量的乳酪蛋白，加入 200 ml 纯水，在 85 ℃ 的恒温条件下加热预处理15 min，冷却到适当的温度，调整 pH，加入一定量的蛋白酶，水解一段时间，水解过程中保持pH不变，反应结束后，升温至 85 ℃ 灭酶 10 min。酶解液冷却离心，取上清液冷冻干燥后冷藏备用。
1.2.2水解酶的选择。以水解度为考察指标，按“1.2.1”的酶解方法，考察碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的酶解能力，确定酶解乳酪蛋白的最佳水解酶，蛋白酶的酶解条件如表 1 所示。
1.2.3单因素试验。取上述水解酶酶解乳酪蛋白，以水解度为考察指标，考察不同酶解温度、pH、酶解时间、加酶量、底物浓度对酶解效率的影响，初步确定该酶的酶解条件。 1.2.4正交试验。在单因素试验的基础上，根据正交试验的中心组合试验设计原理，进行 L9（34） 正交试验设计，以水解度为考察指标，确定优先酶的最佳酶解条件。
1.2.5水解度（DH）的测定。水解度的测定采用 pHstat 法[8-9]，根据水解过程中消耗的氢氧化钠的量计算水解度：
DH = （B×Nb）/（α×Mp×htot）
式中，B，水解中消耗氢氧化钠的体积 （L）；Nb，所用氢氧化钠的物质的量浓度 （mol/L）；α，α氨基的解离度；Mp，底物蛋白质总量（g） ；htot，毎克底物蛋白质中肽键的克当量（mol/g），乳酪蛋白的 htot为 8.2。
1.2.6分子量的测定。采用凝胶色谱法检测产品的分子量，检测条件为：色谱柱：SuperdexTM 200 10/300 GL；流动相：0.05 mol/L 磷酸缓冲盐缓冲液；流速：0.5 ml/min；检测波长：215 nm。标准蛋白分子量分别为 cytochrome C （12 384 D）、aprotinin （6 512 D）、vitamin B12（1 855 D）、（Gly）3 （189 D）、gly （75 D）。
1.2.7数据处理。所有数据均重复3次，采用 Sigmaplot 软件对试验数据进行统计学分析。
2结果与分析
2.1乳酪蛋白水解酶的确定根据表 1中的蛋白酶的水解条件可以得出，4种蛋白酶对乳酪蛋白的酶解效果各不相同，碱性蛋白酶水解乳酪蛋白时水解度最高，为（21.71±0.15）%；糜蛋白酶水解乳酪蛋白时水解度最低，为（15.03±0.08）%；而中性蛋白酶和胰蛋白酶水解乳酪蛋白时的水解度分别为（19.21±0.27）%、（17.45±0.24）%。因此筛选出碱性蛋白酶为水解乳酪蛋白的最佳蛋白酶。
2.2碱性蛋白酶水解乳酪蛋白的单因素试验
2.2.1酶解温度的影响。在酶添加量为 3%，底物浓度为 4%，pH为 9.0，酶解时间为 240 min 的条件下，考察反应温度为 30、40、50、60、70 ℃ 对水解度的影响。由图 1 可知，开始阶段，水解度随着温度的增加而大幅上升；当温度达到 60 ℃ 时，水解度达到最高；当温度大于 60 ℃ 时，随着温度的增加，水解度反而下降，这是因为温度过高，部分乳酪蛋白肽被降解成氨基酸。因此，选择酶解温度为 60 ℃ 。
2.4乳酪蛋白肽的分子量利用凝胶色谱 SuperdexTM peptide 10/300 GL 检测乳酪蛋白肽的分子量，5 种标准样品的分子量如图 6 所示，以各标准样品分子量的对数值对洗脱体积做标准曲线，得到的回归方程为 lgMr = -0.229 3V+6.375 8（R2=0.992 1）。式中，Mr 为分子量，V 为洗脱体积。通过乳酪蛋白肽的洗脱体积（图7）计算试验制备的乳酪蛋白肽的分子量为 2 kD。参考文献
[1] 汪玉松， 邹思湘.乳生物化学[M].长春： 吉林大学出版社， 1995.
[2] EBNER J，ASCI ARSLAN A，FEDOROVA M，et al.Peptide profiling of bovine kefir reveals 236 unique peptides released from caseins during its production by starter culture or kefir grains[J].Journal of proteomics， 2015， 117： 41-57.、
[3] TANG W T，YUAN H N，ZHANG H，et al.An antimicrobial peptide screened from casein hydrolyzate by Saccharomyces cerevisiae cell membrane affinity method[J].Food control， 2015， 50： 413-422.
[4] CARCATEJEDOR A，SNCHEZRIVERA L，RECIO I，et al.Dairy Debaryomyces hansenii strains produce the antihypertensive caseinderived peptides LHLPLP and HLPLP[J].LWTfood science and technology， 2015， 61： 550-556.
[5] NONGONIERMA A B，FITZGERALD R J.Inhibition of dipeptidyl peptidase IV （DPPIV） by proline containing caseinderived peptides[J].Journal of functional foods， 2013， 5： 1909-1917.
[6] SU R X，LIANG M，QI W，et al.Pancreatic hydrolysis of bovine casein： Peptide release and timedependent reaction behavior[J].Food chemistry， 2012， 133： 851-858.
[7] 陳东平，牟光庆.不同分子量酪蛋白肽对自由基清除作用研究[J].中国酿造， 2010（4）：33-35.
[8] BOUGATEF A，NEDJARARROUME N，RAVALLECPL，R et al.Angiotensin Ιconverting enzyme （ACE） inhibitory activities of sardinelle （Sardinella aurita） byproducts protein hydrolysates obtained by treatment with microbial and visceral fish serine proteases[J].Food chemistry， 2008， 111： 350-356.
[9] 胡新颖.山核桃蛋白多肽制备方法的研究[D].长春： 吉林农业大学，2002.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（26）：364-365，372