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【关键词】 大鼠关节组织;硝酸脱钙;EDTA脱钙;石蜡制片
骨组织脱钙技术是病理实验室常用技术之一。它的应用,使难以切片或不能完整制片的骨或软骨组织达到完整制片的目的。适用组织化学、免疫组化等技术的染色。大鼠关节组织制片的关键步骤是脱钙,其直接影响到制片的成败。现在大鼠关节组织石蜡制片实验中,分别用10%硝酸和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)复合液进行脱钙处理后,石蜡包埋、制片、染色。对用两种方法脱钙处理的大鼠关节组织石蜡制片后染色,镜下观察形态及着色效果。
1 材料与方法
1.1 材料 大鼠30只、出生10周,平均体质量400 g(购自中山大学动物实验)。雌雄不限,随机分组。在麻醉状态下经心脏注射生理盐水及1%多聚甲醛处死动物,取关节组织、标本置10%甲醛固定液中固定24 h。10%的硝酸脱钙液。EDTA脱钙液,微波炉。
1.2 方法 10%硝酸脱钙液的配制及脱钙方法
将1份的硝酸溶液加入到9份的蒸馏水中搅拌均匀即可。将大鼠关节组织放入是组织体积20倍量的10%硝酸溶液中,浸泡16～18 h,浸泡中无需更换脱钙液,用针能刺入即可。取出组织置流水中冲洗碱化2 h。取材,入脱水机石蜡包埋、切片、染色。
1.3 EDTA脱钙液的配制及脱钙方法 用PBS缓冲液(pH7.2)100 ml、加NaOH搅拌溶解至饱合状态,再加入EDTA10 g溶解后用1 mol/L Hcl调节pH值至7.2,加甲醛15 ml即可。把脱钙液装入小烧杯中,将大鼠关节组织放置其中,脱钙液需充足。放入微波炉中调节微波功率50℃,微波照射50 s即可达到脱钙的目的。取出无需流水冲洗、直接取材、入脱水机、石蜡包埋、切片、染色。
2 结果
10%硝酸脱钙处理的大鼠关节组织切片组织结构尚完整,组织块也能顺利连续切片,镜下:细胞形态、结构尚清,HE着色较淡,有时细胞核仁及膜边界不太清晰,分界不清,对比度不强。在特殊染色和免疫组化染色中,着色较困难,效果欠佳。
EDTA复合脱钙液处理的大鼠关节组织、切片结构完整,组织块能顺利连续切片,镜下:细胞形态结构清晰,边界清楚,核浆、胞膜分明,胞核较前更清晰。HE着色鲜艳,特殊染色及免疫组化染色表达准确,对比度强。
3 讨论
大鼠关节组织石蜡切片制作,用酸性脱钙液处理时,脱钙时间需16～18 h,流水碱化2 h,所用时间较长,脱钙液对组织结构有破坏现象,不利于保持组织细胞的结构完整,尤其是对组织细胞容易造成细胞内的各种抗原蛋白质丢失和酶的活性减弱。组织在酸中长时间脱钙,组织中始终存有残留的酸性物质附在蛋白质上,与同样带有负电荷呈酸性的伊红染料相互排斥,伊红着色困难。HE染液中的苏木精在染色时细胞核内的染色质主要是脱氧核糖核酸,它的双螺旋结构中两条链上的磷酸基向外,呈酸性带负电荷易与带正电荷苏木精染料结合着色。而细胞质中的蛋白质为两性化合物,它的染色与pH有关。当pH调到蛋白质等电点4.7～5.0时,胞质对外不显性,此时酸性、碱性染料都不易着色。当pH为6.7~6.8时,大于蛋白质的等电点,呈酸性电离,而带负电荷的阴离子被带正电荷的苏木素染料染色,核和胞质难以区分[1]。这就是造成HE着色不佳的原因。各项特殊化学染色也受以上原因影响,着色效果不佳。免疫组化染色,因组织抗原在酸性脱钙时损失,及酶活性减弱,使抗原决定簇减少,不能充分暴露,其表达信号得不到放大,至使阳性表达有时呈阴性表达,影响了实验的准确性。
大鼠关节组织用EDTA脱钙需1～2周[2],脱钙时间较长,但EDTA在微波照射下进行脱钙,时间缩短至50 s,极大地节约制片时间提高了工作效率。微波是高频电磁波,电磁波照射加速了骨组织内分子的高速运动,通过热效应直接作用于其化学键[3]促进了EDTA的螯合作用,使组织中骨基质中钙盐快速脱出。它的脱钙作用优于酸性脱钙液,对组织细胞内的各种抗原和酶的活性保存较好,染色效果理想,保证了实验的准确性。制片时要注意几个方面:①脱钙前用10%甲醛固定组织,这样即加速脱钙速度,同时可很好保存骨组织中的蛋白质抗原[4];②包埋时应将组织放平,切片时将较硬的一端放在与刀平行面的上端,最好用防脱片捞片;③严格控制微波照射时间和温度,组织较小时,脱钙温度不宜过高,脱钙液要充足,是标本体积的20倍。此方法适用于临床骨组织的脱钙。
参考文献
[1] 王伯沄,李玉松,黄高昇,等.病理学技术.人民卫生出版社,2000:117.
[2] 杜卓民.实用组织学技术.人民卫生出版社,1998:232-233.
[3] 席越,王戈平,黄啸原,等.骨组织病理解剖学技术.人民卫生出版社,1997:330-331.
[4] 申姜颖,李伟,黄庆玉,等.微波辐射下螯合剂脱钙技术在骨大切片制作中的应用.中华病理学杂志,2000,29(6):466-467.
骨组织脱钙技术是病理实验室常用技术之一。它的应用,使难以切片或不能完整制片的骨或软骨组织达到完整制片的目的。适用组织化学、免疫组化等技术的染色。大鼠关节组织制片的关键步骤是脱钙,其直接影响到制片的成败。现在大鼠关节组织石蜡制片实验中,分别用10%硝酸和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)复合液进行脱钙处理后,石蜡包埋、制片、染色。对用两种方法脱钙处理的大鼠关节组织石蜡制片后染色,镜下观察形态及着色效果。
1 材料与方法
1.1 材料 大鼠30只、出生10周,平均体质量400 g(购自中山大学动物实验)。雌雄不限,随机分组。在麻醉状态下经心脏注射生理盐水及1%多聚甲醛处死动物,取关节组织、标本置10%甲醛固定液中固定24 h。10%的硝酸脱钙液。EDTA脱钙液,微波炉。
1.2 方法 10%硝酸脱钙液的配制及脱钙方法
将1份的硝酸溶液加入到9份的蒸馏水中搅拌均匀即可。将大鼠关节组织放入是组织体积20倍量的10%硝酸溶液中,浸泡16～18 h,浸泡中无需更换脱钙液,用针能刺入即可。取出组织置流水中冲洗碱化2 h。取材,入脱水机石蜡包埋、切片、染色。
1.3 EDTA脱钙液的配制及脱钙方法 用PBS缓冲液(pH7.2)100 ml、加NaOH搅拌溶解至饱合状态,再加入EDTA10 g溶解后用1 mol/L Hcl调节pH值至7.2,加甲醛15 ml即可。把脱钙液装入小烧杯中,将大鼠关节组织放置其中,脱钙液需充足。放入微波炉中调节微波功率50℃,微波照射50 s即可达到脱钙的目的。取出无需流水冲洗、直接取材、入脱水机、石蜡包埋、切片、染色。
2 结果
10%硝酸脱钙处理的大鼠关节组织切片组织结构尚完整,组织块也能顺利连续切片,镜下:细胞形态、结构尚清,HE着色较淡,有时细胞核仁及膜边界不太清晰,分界不清,对比度不强。在特殊染色和免疫组化染色中,着色较困难,效果欠佳。
EDTA复合脱钙液处理的大鼠关节组织、切片结构完整,组织块能顺利连续切片,镜下:细胞形态结构清晰,边界清楚,核浆、胞膜分明,胞核较前更清晰。HE着色鲜艳,特殊染色及免疫组化染色表达准确,对比度强。
3 讨论
大鼠关节组织石蜡切片制作,用酸性脱钙液处理时,脱钙时间需16～18 h,流水碱化2 h,所用时间较长,脱钙液对组织结构有破坏现象,不利于保持组织细胞的结构完整,尤其是对组织细胞容易造成细胞内的各种抗原蛋白质丢失和酶的活性减弱。组织在酸中长时间脱钙,组织中始终存有残留的酸性物质附在蛋白质上,与同样带有负电荷呈酸性的伊红染料相互排斥,伊红着色困难。HE染液中的苏木精在染色时细胞核内的染色质主要是脱氧核糖核酸,它的双螺旋结构中两条链上的磷酸基向外,呈酸性带负电荷易与带正电荷苏木精染料结合着色。而细胞质中的蛋白质为两性化合物,它的染色与pH有关。当pH调到蛋白质等电点4.7～5.0时,胞质对外不显性,此时酸性、碱性染料都不易着色。当pH为6.7~6.8时,大于蛋白质的等电点,呈酸性电离,而带负电荷的阴离子被带正电荷的苏木素染料染色,核和胞质难以区分[1]。这就是造成HE着色不佳的原因。各项特殊化学染色也受以上原因影响,着色效果不佳。免疫组化染色,因组织抗原在酸性脱钙时损失,及酶活性减弱,使抗原决定簇减少,不能充分暴露,其表达信号得不到放大,至使阳性表达有时呈阴性表达,影响了实验的准确性。
大鼠关节组织用EDTA脱钙需1～2周[2],脱钙时间较长,但EDTA在微波照射下进行脱钙,时间缩短至50 s,极大地节约制片时间提高了工作效率。微波是高频电磁波,电磁波照射加速了骨组织内分子的高速运动,通过热效应直接作用于其化学键[3]促进了EDTA的螯合作用,使组织中骨基质中钙盐快速脱出。它的脱钙作用优于酸性脱钙液,对组织细胞内的各种抗原和酶的活性保存较好,染色效果理想,保证了实验的准确性。制片时要注意几个方面:①脱钙前用10%甲醛固定组织,这样即加速脱钙速度,同时可很好保存骨组织中的蛋白质抗原[4];②包埋时应将组织放平,切片时将较硬的一端放在与刀平行面的上端,最好用防脱片捞片;③严格控制微波照射时间和温度,组织较小时,脱钙温度不宜过高,脱钙液要充足,是标本体积的20倍。此方法适用于临床骨组织的脱钙。
参考文献
[1] 王伯沄,李玉松,黄高昇,等.病理学技术.人民卫生出版社,2000:117.
[2] 杜卓民.实用组织学技术.人民卫生出版社,1998:232-233.
[3] 席越,王戈平,黄啸原,等.骨组织病理解剖学技术.人民卫生出版社,1997:330-331.
[4] 申姜颖,李伟,黄庆玉,等.微波辐射下螯合剂脱钙技术在骨大切片制作中的应用.中华病理学杂志,2000,29(6):466-467.