【摘 要】
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目的 观察靶向小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的小干扰RNA(siRNA)在体外对小鼠巨噬细胞系RAW264.7表达TNF-α的抑制作用.方法 采用化学法合成针对TNF-α mRNA不同位点设计的
【机 构】
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广州医学院附属广州市第一人民医院消化内科
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目的 观察靶向小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的小干扰RNA(siRNA)在体外对小鼠巨噬细胞系RAW264.7表达TNF-α的抑制作用.方法 采用化学法合成针对TNF-α mRNA不同位点设计的3条siRNA序列(siRNA1～3)和1条带有荧光标记的BLOCK-ITTM荧光Oligo(修饰的荧光标记的dsRNA,siRNA4)通过脂质体包裹后将其分别转染至小鼠巨噬细胞系RAW264.7,同时设立1个无任何靶基因的siRNA作为阴性对照(siRNA4).荧光显微镜下观察siRNA的转染效率;用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测siRNA对TNF-α的mRNA和蛋白表达的抑制作用.结果 内毒素刺激后6 h,巨噬细胞表达TNF-α mRNA和合成分泌的TNF-α量均增加,于9～12 h达高峰.利用荧光标记的Oligo观察到siRNA转染效率达72%～80%.siRNA1～4转染巨噬细胞后,siRNA2、3可见内毒素刺激的TNF-α mRNA(0.158±0.030、0.114±0.028)和TNF-α蛋白表达[(1355 4±348)ps/ml、(817±138)pg/ml]均明显少于未转染组[TNF-α mRNA 0.294±0.147,蛋白(2104±32)pg/ml,均P＜0.05],其中siRNA3的抑制率非常显著,达61.2%(P＜0.01).阴性对照siRNA4对细胞基因及蛋白表达无影响.结论 内毒素可刺激小鼠巨噬细胞TNF-α的合成.化学合成siRNA转染小鼠巨噬细胞能有效抑制TNF-α mRNA及蛋白的表达.
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