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【摘要】综述了近年来硫酸软骨素及其衍生物的制备、分离纯化、衍生化和应用研究等方面的研究进展。
【关键词】硫酸软骨素;制备;衍生化;应用研究
硫酸软骨素（CS）/硫酸皮肤素（DS）是天然大分子，是属于糖胺聚糖（GAG）类的主要杂多糖，是仅次于硫酸乙酰肝素（HS）的第二大异质性GAG组，在功能上表现为细胞周基质、细胞内环境和细胞外基质（ECM）中的CS蛋白聚糖（CSPG）。CS因硫酸基的数目和位置可衍生出CS的各种异构体，其中最为常见的是CSA（4-O-硫酸基）和CSC（6-O-硫酸基）。
几十年来，人们一直在研究CS修饰物在癌症进展中的作用。在实体瘤中，CS 参与促进肿瘤细胞粘附而促进恶性细胞的侵袭和转移行为;在胚胎发育期间，CS在CSPGs中具有重要的形态发生的功能。为了进一步优化CS的生物活性，将CS进行不同程度的衍生化并探讨其应用前景。
1、制备
1.1 提取法
动物提取法主要是碱提取法、酶提取法、沉淀法、超声法及有机溶剂沉淀法等，但制备的产品均为粗品。单一的提取方法主要存在周期长、污染重、时间长等问题。
1.2 发酵法
CS不仅是脊椎动物细胞外基质中极其重要的糖胺聚糖（GAG），还是一种包含几种细菌的荚膜多糖。CS仍然从有限且可能有害的动物中提取，例如鸡龙骨、鱼翅和猪或牛的气管。目前采用大肠杆菌K4或其在不同背景下的生物发酵和合成机制来生成用于生产软骨素的细胞工厂，并获得了较好的成果。
泌尿病原体菌株的荚膜多糖由N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）和葡萄糖醛酸（GlcA）的交替残基组成，其结构与CS的骨架非常相似。不同之处在于GlcA残基上是否存在果糖和硫酸根。
与CS相比，由重组大肠杆菌K4产生的软骨素（BC）进行了评估，结果显示：IL-1b处理的软骨细胞中炎症反应降低程度更高，并增强了它们的增殖和表型保存。此外，最近完成了通过果糖分支裂解和选择性硫酸化将生物技术软骨素化学转化为CS。然而，培养基中的大肠杆菌K4也会释放脂多糖，这些脂多糖是主要的产品污染物，需要在纯化中去除。
2、分离纯化
分离纯化CS的方法有很多，如季铵盐法、离子交换法以及超滤—离子层析法等。
Gábor Tóth等在HILIC的分离中使用盐梯度，提供了相对快速的色谱，同时具有出色的灵敏度（15分钟循环时间，10-20fmol/?L检测，30-50fmol/?L定量限）和良好的线性。通过测量健康、肝硬化和癌变肝脏样本的人体组织切片，证明了新方法的有效性。
魏明等采用回收制备型HPLC来分离和纯化硫酸软骨素寡糖（CSO），并通过多阶段程序衍生化來获得硫酸软骨素。
Léna Jaravel等采用毛细管等速电泳分离纯化硫酸化二糖，再通过CZE、串联质谱和IRMPD光谱的离线耦合对CS进行结构表征。该方法优化了毛细管电泳的分离条件，充分分离对两种CS二糖异构体。
相比于传统的超滤法或离子交换法，采用上述三种方法可以精细的提取CS，所获得的产率和纯度都较传统方法高出很多。
3、衍生化
3.1 低硫酸化
天然CS都是高分子量化合物，其生物利用率低，不易被体内吸收。MartelPelletier等表明低分子量CS可能更容易被吸收。因此选择不同的方法降解CS至关重要，目前主要有酸水解法、酶解法、氧化降解法以及微波辅助碱法。
3.2 多硫酸化
通过控制反应条件将CS进行过硫酸化，可以得到具有不同分子量和不同硫酸化的硫酸化软骨素。虽然发现CS具有最小的抗凝活性，但增加硫酸盐化水平会产生抗凝反应。姬胜利等采用氯磺酸和甲酰胺修饰CS，在改进工艺的同时，也增强了产品的抗凝活性和抗血栓能力。
3.3 脱乙酰化
通过肼基化反应对CS的氨基己糖脱乙酰化，得到游离态的氨基和糖基化CS。Nadkarni等通过对CS进行硫酸肼催化从而得到脱乙酰的CS，且制备的产品获得了75%的产率。
3.4 酯化
通过酯化反应可以有效降低硫酸软骨素B（DS）的抗凝效果，Barzu等先用DS和四丁基铵反应得到DS—四丁基铵盐，再将其分别与卤代烃和卤化苄等反应，得到一系列DS的酯化衍生物。通过对这些衍生物的研究发现，苄基酯的抗凝活性显著降低，但其抗HIV的活性没有发生变化，因此，该类酯化衍生物可作为抗HIV的潜在药物。
3.5 酰化
Park等采用吡啶作为催化剂，将CS与不同分子量的乙酸酐反应，得到一些不同乙酰化程度的CS乙酰化产物。通过研究表明，将这些CS乙酰化产物制备成凝胶能有效结合抗癌药物阿霉素，因此，该乙酰化产物可以作为抗癌药物的载体并投入临床应用。
4、应用研究
4.1 抗肿瘤
在肿瘤生态位中积累的CS可以通过各种宿主细胞（如成纤维细胞或白细胞）的粘附来间接影响癌细胞的侵袭。这些细胞是生长因子和ECM降解酶的重要来源，可刺激癌细胞迁移。此外，CS可以调节肿瘤生态位的ECM结构从而影响癌细胞的传播。
目前CS在癌症的进展中研究表明：由于其抗炎特性，CS可以作为一种缓效抗炎药来预防癌症。此外，考虑到其与CD44相互作用的能力，CS可以作为治疗靶点，以减少宿主细胞对癌症生态位的浸润，这些细胞被假设为癌细胞中耐药性的主要介质。另一方面，由于其带负电荷并与多种细胞表面受体（如HARE或上述CD44）结合，CS或其链片段也可用作药物递送载体提高抗癌治疗的特异性和效率。
4.2 抗炎症
CS直接或间接调节抗炎作用，CS是一个大分子，不能穿透软骨细胞，因此它通过与膜受体结合而被内化为寡糖或二糖，通过结合CD44和ICAM1促进IL-1受体相关激酶-M（IRAK-M）（一种IRAK抑制剂）或MKP-1的释放，从而使MAPK去磷酸化。这些作用将减少NF-κB核易位和炎症反应。 软骨和滑液的基本成分是CS，它通过促进二型胶原蛋白和蛋白多糖的合成来诱导软骨代谢。软骨血管的生成要归结于软骨中丢失的CS，这是OA的主要原因。CS作为SYSADOA，在3个级别的骨关节炎（OA）修复中：关节软骨、滑膜、软骨下骨。CS能够调节滑膜成纤维细胞和软骨细胞的功能，因此，它有望成为一种用于OA的多功能软骨保护材料。
4.3 新型载药系统
基于多糖新型药物输送系统已经获得了巨大的成功。在过去几年中，大量基于CS的新型药物递送系统以配体或药物的形式出現。据报道，CS的各种组合可用于治疗OA，例如CS4和CS6与葡萄糖胺，葡萄糖胺和抗氧化剂微量营养素，透明质酸，槲皮素衍生物，或饮食补充剂，如葡萄糖胺、抗氧化剂和绿唇贻贝、GLU、CS与二十碳五烯酸 （EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和绿唇贻贝提取物等。
综上所述，硫酸软骨素及其衍生物的开发仍有很大的前景。目前市场上的硫酸软骨素仍然采用化学方法提取，力求改进生产工艺，减少污染，降低成本。在目前研究中表明，多硫酸化硫酸软骨素（PSCS）通过延长凝血时间和增强血浆中的凝血酶抑制作用而作为抗凝剂使用。尽管向硫酸软骨素中添加额外的硫酸盐增加了抗凝血活性，但当硫酸化从3.0增加到4.0时，用肝素辅因子II测量的抗凝血活性降低，因此，适当的修饰可以增强其相关活性。开发活性较好的CS衍生物是增强CS活性的一种不错的方式，并将其广泛应用于食品、工业生产以及医疗器械中。
参考文献：
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【关键词】硫酸软骨素;制备;衍生化;应用研究
硫酸软骨素（CS）/硫酸皮肤素（DS）是天然大分子，是属于糖胺聚糖（GAG）类的主要杂多糖，是仅次于硫酸乙酰肝素（HS）的第二大异质性GAG组，在功能上表现为细胞周基质、细胞内环境和细胞外基质（ECM）中的CS蛋白聚糖（CSPG）。CS因硫酸基的数目和位置可衍生出CS的各种异构体，其中最为常见的是CSA（4-O-硫酸基）和CSC（6-O-硫酸基）。
几十年来，人们一直在研究CS修饰物在癌症进展中的作用。在实体瘤中，CS 参与促进肿瘤细胞粘附而促进恶性细胞的侵袭和转移行为;在胚胎发育期间，CS在CSPGs中具有重要的形态发生的功能。为了进一步优化CS的生物活性，将CS进行不同程度的衍生化并探讨其应用前景。
1、制备
1.1 提取法
动物提取法主要是碱提取法、酶提取法、沉淀法、超声法及有机溶剂沉淀法等，但制备的产品均为粗品。单一的提取方法主要存在周期长、污染重、时间长等问题。
1.2 发酵法
CS不仅是脊椎动物细胞外基质中极其重要的糖胺聚糖（GAG），还是一种包含几种细菌的荚膜多糖。CS仍然从有限且可能有害的动物中提取，例如鸡龙骨、鱼翅和猪或牛的气管。目前采用大肠杆菌K4或其在不同背景下的生物发酵和合成机制来生成用于生产软骨素的细胞工厂，并获得了较好的成果。
泌尿病原体菌株的荚膜多糖由N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）和葡萄糖醛酸（GlcA）的交替残基组成，其结构与CS的骨架非常相似。不同之处在于GlcA残基上是否存在果糖和硫酸根。
与CS相比，由重组大肠杆菌K4产生的软骨素（BC）进行了评估，结果显示：IL-1b处理的软骨细胞中炎症反应降低程度更高，并增强了它们的增殖和表型保存。此外，最近完成了通过果糖分支裂解和选择性硫酸化将生物技术软骨素化学转化为CS。然而，培养基中的大肠杆菌K4也会释放脂多糖，这些脂多糖是主要的产品污染物，需要在纯化中去除。
2、分离纯化
分离纯化CS的方法有很多，如季铵盐法、离子交换法以及超滤—离子层析法等。
Gábor Tóth等在HILIC的分离中使用盐梯度，提供了相对快速的色谱，同时具有出色的灵敏度（15分钟循环时间，10-20fmol/?L检测，30-50fmol/?L定量限）和良好的线性。通过测量健康、肝硬化和癌变肝脏样本的人体组织切片，证明了新方法的有效性。
魏明等采用回收制备型HPLC来分离和纯化硫酸软骨素寡糖（CSO），并通过多阶段程序衍生化來获得硫酸软骨素。
Léna Jaravel等采用毛细管等速电泳分离纯化硫酸化二糖，再通过CZE、串联质谱和IRMPD光谱的离线耦合对CS进行结构表征。该方法优化了毛细管电泳的分离条件，充分分离对两种CS二糖异构体。
相比于传统的超滤法或离子交换法，采用上述三种方法可以精细的提取CS，所获得的产率和纯度都较传统方法高出很多。
3、衍生化
3.1 低硫酸化
天然CS都是高分子量化合物，其生物利用率低，不易被体内吸收。MartelPelletier等表明低分子量CS可能更容易被吸收。因此选择不同的方法降解CS至关重要，目前主要有酸水解法、酶解法、氧化降解法以及微波辅助碱法。
3.2 多硫酸化
通过控制反应条件将CS进行过硫酸化，可以得到具有不同分子量和不同硫酸化的硫酸化软骨素。虽然发现CS具有最小的抗凝活性，但增加硫酸盐化水平会产生抗凝反应。姬胜利等采用氯磺酸和甲酰胺修饰CS，在改进工艺的同时，也增强了产品的抗凝活性和抗血栓能力。
3.3 脱乙酰化
通过肼基化反应对CS的氨基己糖脱乙酰化，得到游离态的氨基和糖基化CS。Nadkarni等通过对CS进行硫酸肼催化从而得到脱乙酰的CS，且制备的产品获得了75%的产率。
3.4 酯化
通过酯化反应可以有效降低硫酸软骨素B（DS）的抗凝效果，Barzu等先用DS和四丁基铵反应得到DS—四丁基铵盐，再将其分别与卤代烃和卤化苄等反应，得到一系列DS的酯化衍生物。通过对这些衍生物的研究发现，苄基酯的抗凝活性显著降低，但其抗HIV的活性没有发生变化，因此，该类酯化衍生物可作为抗HIV的潜在药物。
3.5 酰化
Park等采用吡啶作为催化剂，将CS与不同分子量的乙酸酐反应，得到一些不同乙酰化程度的CS乙酰化产物。通过研究表明，将这些CS乙酰化产物制备成凝胶能有效结合抗癌药物阿霉素，因此，该乙酰化产物可以作为抗癌药物的载体并投入临床应用。
4、应用研究
4.1 抗肿瘤
在肿瘤生态位中积累的CS可以通过各种宿主细胞（如成纤维细胞或白细胞）的粘附来间接影响癌细胞的侵袭。这些细胞是生长因子和ECM降解酶的重要来源，可刺激癌细胞迁移。此外，CS可以调节肿瘤生态位的ECM结构从而影响癌细胞的传播。
目前CS在癌症的进展中研究表明：由于其抗炎特性，CS可以作为一种缓效抗炎药来预防癌症。此外，考虑到其与CD44相互作用的能力，CS可以作为治疗靶点，以减少宿主细胞对癌症生态位的浸润，这些细胞被假设为癌细胞中耐药性的主要介质。另一方面，由于其带负电荷并与多种细胞表面受体（如HARE或上述CD44）结合，CS或其链片段也可用作药物递送载体提高抗癌治疗的特异性和效率。
4.2 抗炎症
CS直接或间接调节抗炎作用，CS是一个大分子，不能穿透软骨细胞，因此它通过与膜受体结合而被内化为寡糖或二糖，通过结合CD44和ICAM1促进IL-1受体相关激酶-M（IRAK-M）（一种IRAK抑制剂）或MKP-1的释放，从而使MAPK去磷酸化。这些作用将减少NF-κB核易位和炎症反应。 软骨和滑液的基本成分是CS，它通过促进二型胶原蛋白和蛋白多糖的合成来诱导软骨代谢。软骨血管的生成要归结于软骨中丢失的CS，这是OA的主要原因。CS作为SYSADOA，在3个级别的骨关节炎（OA）修复中：关节软骨、滑膜、软骨下骨。CS能够调节滑膜成纤维细胞和软骨细胞的功能，因此，它有望成为一种用于OA的多功能软骨保护材料。
4.3 新型载药系统
基于多糖新型药物输送系统已经获得了巨大的成功。在过去几年中，大量基于CS的新型药物递送系统以配体或药物的形式出現。据报道，CS的各种组合可用于治疗OA，例如CS4和CS6与葡萄糖胺，葡萄糖胺和抗氧化剂微量营养素，透明质酸，槲皮素衍生物，或饮食补充剂，如葡萄糖胺、抗氧化剂和绿唇贻贝、GLU、CS与二十碳五烯酸 （EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和绿唇贻贝提取物等。
综上所述，硫酸软骨素及其衍生物的开发仍有很大的前景。目前市场上的硫酸软骨素仍然采用化学方法提取，力求改进生产工艺，减少污染，降低成本。在目前研究中表明，多硫酸化硫酸软骨素（PSCS）通过延长凝血时间和增强血浆中的凝血酶抑制作用而作为抗凝剂使用。尽管向硫酸软骨素中添加额外的硫酸盐增加了抗凝血活性，但当硫酸化从3.0增加到4.0时，用肝素辅因子II测量的抗凝血活性降低，因此，适当的修饰可以增强其相关活性。开发活性较好的CS衍生物是增强CS活性的一种不错的方式，并将其广泛应用于食品、工业生产以及医疗器械中。
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[4] Pude?ko A.， Wisowski G.， Olczyk K.， Ko?ma E.M. The dual role of the glycosaminoglycan chondroitin-6-sulfate in the development， progression and metastasis of cancer. FEBS J. 2019;286：1815–1837.
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[11] 甘肃农业大学. 一种牛或羊硫酸软骨素生产工艺[P]. CN 201010248061.1，2012-07-25.
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