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摘 要：采用自然发酵传统腌腊肉制品中分离鉴定出的1 株乳酸菌（植物乳杆菌10M-7）制成干粉发酵剂，将其应用于风干肠的生产加工，以未添加发酵剂的自然发酵风干肠作为对照，研究乳酸菌发酵剂的添加对风干肠风味品质的影响。结果表明：实验组风干肠加工初期的pH值迅速下降，且风干成熟后，其pH值明显低于对照组；电子鼻分析结果表明，添加乳酸菌发酵剂的实验组风干肠的风味与对照组存在明显差异；气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析结果表明，乳酸菌发酵剂的添加能够有效促进风干肠产品中醇类、酮类和酸类物质相对含量的提高，且实验组风干肠中检出的腌腊肉制品呈香特征物质种类较多，相对含量较高，如3-羟基-2-丁酮、乙酸乙酯、2-庚酮和2-壬酮；感官评价结果表明，添加乳酸菌发酵剂能够改善和提高风干肠的风味，产品的整体可接受性优于对照组。
关键词：乳酸菌；发酵剂；风干肠；风味
Abstract： Lactobacillus plantarum 10M-7， a lactic acid bacterium isolated from naturally fermented traditional cured meat product， was used as a starter culture to produce air-dried sausage. Naturally fermented sausages were used as a control to assess the effect of inoculation with Lactobacillus plantarum on the flavor quality of air-dried sausage. The results showed that the pH value decreased rapidly during the early stage of lactic acid bacterial fermentation and its final value was apparently lower than that of the control. The experimental and control groups exhibited high variability in flavor quality as detected by an electronic nose. gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） analysis indicated that the relative contents of alcohols， ketones and acids in the experimental group were higher than in the control group. In the meantime， the types and relative contents of characteristic aroma compounds identified in the experimental group such as 3-hydroxy-2-butanone， butyric acid ethyl ester， 2-heptanone and 2-nonanone were higher. To conclude， addition of the starter culture could improve the flavor quality and overall acceptance of air-dried sausage.
Key words： lactic acid bacteria； starter culture； air-dried sausage； flavor
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712009
中圖分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）12-0050-06
引文格式：
潘晓倩， 成晓瑜， 张顺亮， 等. 乳酸菌发酵剂对风干肠风味品质的影响[J]. 肉类研究， 2017， 31（12）： 50-55. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712009. http：//www.rlyj.pub
PAN Xiaoqian， CHENG Xiaoyu， ZHANG Shunliang， et al. Effects of lactic acid bacteria starter culture on the flavor quality of air-dried sausage[J]. Meat Research， 2017， 31（12）： 50-55. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712009. http：//www.rlyj.pub
风干香肠具有pH值低、含水量低和含盐量高的特点，属于我国北方地区传统发酵肉制品的一种，其耐贮藏、营养价值高，具有广阔的市场空间[1]。风干香肠的传统制作工艺多采用自然发酵，产品质量不稳定、生产周期长且杂菌的生长容易产生毒素，造成食品安全隐患[2]。近年来，很多企业将自然风干成熟工艺改为高温烘烤，这样虽然避免了传统工艺制作的某些缺点，但产品风味质量大大降低[3]。因此，如何使风干香肠在工业化生产中保持其原有的独特风味是目前人们关注的焦点。自然发酵肉制品风味的产生主要依靠内源酶及特定有益微生物的生长代谢作用[4-5]。对于不添加任何香料的风干香肠的研究发现，其挥发性风味物质中有27%来源于微生物发酵[6]，这也体现出微生物发酵在风干香肠风味形成过程中的重要作用。利用现代微生物技术制作肉用发酵剂是实现我国传统发酵肉制品工业化生产的关键[7-8]。 美国在20世纪30年代就报道了发酵剂在香肠制作中的应用，目前人工发酵肉制品的生产工艺及技术在一些欧美国家已经相当成熟，产品有着广阔的消费市场[9-10]。
乳酸菌是肉制品加工中常用的发酵剂菌种[11]，它能进行糖发酵产生乳酸，降低产品pH值或产生细菌素类物质，从而抑制腐败菌和致病菌的生长繁殖和细菌毒素的
产生[12-13]。同时，发酵过程中乳酸菌能够利用一些水解酶类（脂肪酶、蛋白酶）促进肉类中蛋白质和脂肪的分解，改善产品的组织质构，提高肉制品的消化吸收率[14-15]。
此外，发酵过程中形成的醛、酮、醇、羧酸等一系列风味物质和风味前体物质赋予肉制品特殊的发酵风味，大大改善了其风味品质[16-17]。
本研究利用从自然发酵的传统腌腊肉制品中分离纯化出的1 株植物乳杆菌（植物乳杆菌10M-7）制成干粉发酵剂[18]，并将其应用于风干肠的制作，测定不同加工时期的pH值变化，并用电子鼻传感器和固相微萃取-气相色谱-质谱（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法比较添加乳酸菌制作的风干肠与传统方法制作的风干肠的风味组成与变化，旨在为风干肠工业化生产新技术的进一步优化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪后腿肉（瘦肉）、猪背脂 北京中瑞食品有限公司；食盐、白砂糖、曲酒、味精、香辛料 市售。
实验用乳酸菌菌株为本实验室从自然发酵的传统腌腊肉制品中分离纯化出的1 株植物乳杆菌（植物乳杆菌10M-7），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11341。
1.2 仪器与设备
WH82绞肉机 德国Seydelmann公司；OSCAR20真空灌肠机 德国海因里希弗雷机械制造有限公司；HWS-150恒温恒湿箱 上海森信实验仪器有限公司；BSA822-CW电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PEN3便携式电子鼻传感器 德国Airsense公司；75 ?m二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）固相微萃取针、DB-Wax GC毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 ?m） 美国J&W公司；TRACE 1310-TSQ 8000 GC-MS仪 美国Thermo公司。
1.3 方法
1.3.1 风干肠的加工
风干肠的加工工艺：脂肪切丁，过夜腌制（加食盐）→原料肉（剔除结缔组织等）→绞肉（瘦肉与脂肪均使用8 mm孔径孔板）→加入调味料和发酵剂搅拌→胶原蛋白肠衣灌制→发酵（温度23 ℃，相对湿度80%，时间24 h）→风干成熟（温度10 ℃，相对湿度80%）→成品
风干肠的配方：猪瘦肉80 g、猪背脂20 g、食盐2.0%、白砂糖1.0%、曲酒1.0%、味精0.2%、香辛料0.5%、异抗坏血酸钠0.1%（均为在原料肉中的质量分数）。
将植物乳杆菌10M-7制成干粉发酵剂，其活力为4.75×1010 CFU/g[18]。乳酸菌发酵剂的添加量为
104 CFU/g。对照组为采用未添加任何发酵剂的传统方法制作的风干肠。
1.3.2 pH值测定
分别取风干肠加工第0、1、4、7、12天样品的不同部位若干块，混合后均质，用pH计测定其pH值，每组样品平行测定6 次。
1.3.3 电子鼻分析
PEN3型电子鼻具有10 种金属氧化物半导体型（metal oxide semiconductor，MOS）化学传感元件，每种化学传感器对应的敏感物质类型不同（表1）。乳酸菌发酵剂菌株在肠体内繁殖并生成各种代谢产物，进而对风干肠中风味物质的种类和含量产生影响，在传感器上呈现不同的气味感应信号[19]。
样品制备：准确称取成熟第12天的风干肠样品2 g，切碎，置于10 mL样品瓶中密封，室温环境下平衡2 h，用PEN3型便携式电子鼻传感器对样品进行检测。传感器响应信号在60 s后基本稳定，分析的时间点宜选取在响应稳定的时间范围内，本研究选取70 s处作为信号采集时间点。每组样品平行测定6 次。
1.3.4 样品的SPME
称取成熟第12天的风干肠样品5.00 g，切碎，装入20 mL的SPME顶空中，旋紧盖子，置于50 ℃恒温水浴锅中平衡30 min，然后将经过老化处理的SPME针头插入瓶中，保持纤维头处于顶空状态，吸附40 min。
1.3.5 GC-MS条件
参照张根生等[1]的方法，并略作修改。
GC条件：DB-Wax极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：进样口温度230 ℃，起始柱温40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升至200 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率升至230 ℃，保持3 min；采用不分流进样模式；载气为高纯氦气（纯度>99.99%），流速1.0 mL/min（恒定）。
MS条件：传输线温度230 ℃；離子源温度280 ℃；质量扫描范围40～600 u。
风味组分的GC-MS检测结果通过计算机检索，选取匹配度和反匹配度均大于800的化合物进行定性分析，并根据面积归一化法计算各挥发性化合物的相对含量。
1.3.6 感官评价
将风干肠蒸煮20 min后切片，每片厚度约为0.5 cm。随机邀请15 位专业人员组成评定小组，采用双盲法对产品的色泽、风味、口感、酸味及整体可接受性进行评价，各项指标的最高得分为7 分，最低为1 分。评分标准如表2所示[20]。 1.4 数据处理
电子鼻测定结果利用其配套的Winmuster软件对数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）；采用Excel 2007软件进行数据整理、统计和制图；采用SPSS 17.0软件对数据进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 风干肠加工过程中的pH值变化
由图1可知，未添加乳酸菌发酵剂的传统风干肠在整个加工过程中pH值略有下降（由5.87降至5.72），这可能是由于传统风干肠中天然存在的少量乳酸菌的生长产酸与内源酶降解蛋白质产生非蛋白氮的综合作用[14]。添加乳酸菌发酵剂的风干肠成熟0～1 d时的pH值下降缓慢，这可能是由于发酵剂干粉在肠体中需要一段时间的适应增殖过程；成熟1～7 d时，乳酸菌大量繁殖产酸，导致产品pH值迅速下降（由5.75降至5.32）；成熟后期（7～12 d），风干肠的pH值降幅变缓，这主要是由于产品的水分活度随风干过程的进行而迅速降低，抑制了乳酸菌的繁殖。
对采用2 种制作方法制成的风干肠进行电子鼻检测，采用PCA建立2 组产品制作完成后（即成熟第12天）的响应模型。由图2可知，主成分1和主成分2的贡献率分别为65.88%和29.42%，总贡献率为95.30%，大于90%；2 组产品的数据点均分布在各自区域内，没有重合，表明2 个主成分基本代表了所测样品的主要信息特征，且采用PCA方法能够区分出加入乳酸菌发酵剂后风味有所改变的产品。当组间判别指数高于80%时，说明组间区分明显[21]，对照组与添加乳酸菌发酵剂的实验组产品间的判别指数为97%，表明2 组产品的风味具有明显差异。
2.3 风干肠加工过程中的挥发性风味物质分析
由表3～4可知，生产结束时，对照组和实验组风干肠中均检测出62 种挥发性化合物，其中，添加发酵剂的风干肠中醇类、酮类和酸类物质的相对含量分别为15.20%、8.46%和12.19%，明显高于对照组；而对照组风干肠中烃类物质的相对含量为44.69%，明显高于实验组；对照组风干肠的醛类和酯类化合物的相对含量分别为3.10%和14.75%，略高于实验组的2.41%和12.37%。
对于检出的醇类化合物，实验组风干肠中芳樟醇和2，3-丁二醇的相对含量较高。芳樟醇是重要的呈味萜类物质，主要来源于香辛料，随着发酵的进行，其含量可能发生改变[1]。2，3-丁二醇是金华火腿等多种腌腊肉制品中的特征风味物质，可能来自于微生物的作用，但也有研究称由于2，3-丁二醇沸点较高（179～182 ℃），因此其对肉制品的整体风味贡献不大[22]。
在检出的酮类化合物中，3-羟基-2-丁酮在2 组产品中的相对含量差异较大（实验组为7.35%，对照组为1.95%），3-羟基-2-丁酮带有甜香、乳制品香，且具有脂肪的油腻气味[23]；实验组中2-庚酮和2-壬酮的相对含量分别为0.42%和0.19%，而这2 种物质在对照组中未检出，2-庚酮具有香蕉、奶酪及轻微的药香，2-壬酮带有果香、甜香、蜡香和皂香等气味[23]。酮类物质主要来源于内源酶和微生物作用下游离脂肪酸的不完全β氧化和氨基酸类物质的降解，在腌腊肉制品中起到增强风味的作用，且不同微生物菌株生成酮类物质的能力也有所差异[24]。
实验组风干肠中酸类物质的种类和相对含量均高于对照组，这与加工过程中产品pH值的变化规律相符，主要与乳酸菌的生长繁殖及代谢产酸有关。实验组风干肠中含量较高的主要是乙酸、戊酸和异戊酸，异戊酸稀释后具有干酪、乳制品和水果香气[23]。
对照组风干肠中醛类物质的相对含量略高于实验组，主要包括庚醛、壬醛等。醛类物质阈值较低，是腌腊肉制品中重要的风味物质，主要来自于油酸、亚油酸及亚麻酸等不饱和脂肪酸的氧化作用，常具有清香、果香和脂香[22-23]。
对于检出的酯类化合物，实验组风干肠中乙酸乙酯、异戊酸乙酯的相对含量分别为3.74%和2.03%，明显高于对照组；对照组风干肠中邻苯二甲酸二丁酯的相对含量为6.35%，而实验组未检出。乙酸乙酯是腌腊肉制品典型特征风味的来源之一，具有醚香、果香，同时还有酒样味道[23]，其来自于酸和醇的酯化反应。Ansorena[25]、Sidira[26]等的研究表明，由微生物生长代谢产生的酯类物质中乙酸乙酯含量最高，且乳酸菌发酵碳水化合物生成的多种酸类物质是形成酯类物质的前体。
2 组产品中均有大量烃类物质检出，一般饱和烃类物质阈值较高，对肉制品风味贡献不大，而柠檬烯等萜烯类风味成分主要来自于香辛料，且在风干肠制作过程中含量有所增加，使风干肠的风味更加和谐[1]。
综上所述，乳酸菌发酵剂的添加能够影响风干肠中风味物质的形成，在成熟过程中，风味物质的种类和相对含量均有不同程度的变化，这可能是由于乳酸菌代谢造成乳酸等物质的积累和pH值的下降，促进蛋白质降解，改变了风干肠中的微生物菌群结构，影响脂肪氧化和氨基酸降解等生化反应，进而影响风干肠最终风味物质的形成[27]。
2.4 风干肠的感官评价
由表5可知，实验组风干肠的风味、口感、酸味和整体可接受性均优于对照组，其中酸味和整体可接受性2 项指标的评分显著高于对照组（P<0.05）。乳酸菌发酵糖类物质产生乳酸，降低产品的pH值，当pH值接近肌肉蛋白的等电点（pI=5.4）时，肌肉蛋白易形成胶状组织，黏着力增强，肉制品的弹性和口感均有所提高[14]。自然发酵的腌腊肉制品中适当的酸味能促进产品风味的形成，但过酸则会降低产品的风味品质。本研究中，大多数评定人员能够接受添加发酵剂制作的风干肠特有的发酵酸味，认为其酸味柔和，香味浓郁。
3 结 论
将本实验室分离筛选的1 株乳酸菌（植物乳杆菌10M-7）制成干粉发酵剂生产风干肠，以未添加发酵剂的自然发酵风干肠作为对照。结果表明，实验组风干肠加工初期的pH值迅速下降，且风干成熟后，其pH值明顯低于对照组，这能够提高产品的食用安全性和可贮藏性；电子鼻分析结果表明，添加乳酸菌发酵剂的实验组风干肠的风味与对照组存在明显差异；GC-MS分析结果表明，乳酸菌发酵剂的添加能够有效促进风干肠产品中醇类、酮类和酸类物质相对含量的提高，且实验组风干肠中检出的腌腊肉制品呈香特征物质种类较多，相对含量较高，如3-羟基-2-丁酮、乙酸乙酯、2-庚酮和2-壬酮。感官评价结果表明，添加乳酸菌发酵剂能够改善和提高风干肠的风味，产品的整体可接受性优于对照组，说明该乳酸菌发酵剂适宜在风干肠产品中使用。本研究为风干肠产品的工业化生产和复合发酵剂的开发提供了参考。 参考文献：
[1] 张根生， 程健博， 岳晓霞， 等. 花椒对哈尔滨风干肠菌系及其菌系对风味的影响[J]. 食品科学， 2017， 38（8）： 184-190. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201708029.
[2] 张文龙. 自然发酵北方风干香肠主要微生物分离及纯菌接种发酵工艺研究[D]. 哈尔滨： 哈尔滨工业大学， 2012： 1-2.
[3] 王虎虎， 刘登勇， 徐幸莲， 等. 我国传统腌腊肉制品产业现状及发展趋势[J]. 肉类研究， 2013， 27（9）： 36-40.
[4] WANG X H， REN H Y， LIU D Y， et al. Effects of inoculating Lactobacillus sakei， starter cultures on the microbiological quality and nitrite depletion of Chinese fermented sausages[J]. Food Control， 2013， 32（2）： 591-596. DOI：10.1016/j.foodcont.2013.01.050.
[5] FERREIRA V， BARBOSA J， VENDEIRO S M， et al. Chemical and microbiological characterization of alheira： a typical Portuguese fermented sausage with particular reference to factors relating to food safety[J]. Meat Science， 2006， 4（3）： 570-575.
[6] BERDAGUE J L， MONTEIL P， MONTEIL M C， et al. Effects of starter cultures on the formation of flavour compounds in dry sausage[J]. Meat Science， 1993， 35（3）： 275-287. DOI：10.1016/0309-1740（93）90033-E.
[7] 符小燕， 郭善广， 蒋爱民， 等. 葡萄球菌和乳酸菌对广式腊肠风味的影响[J]. 肉类研究， 2009， 23（9）： 19-24.
[8] 韩建春. 微生物在风干肠中作用机理的研究及应用[D]. 哈尔滨： 东北农业大学， 2000： 3-15.
[9] LUXANANIL P， PROMCHAI R， WANASEN S， et al. Monitoring Lactobacillus plantarum BCC 9546 starter culture during fermentation of Nham， a traditional Thai port sausage[J]. International Journal of Food Microbiology， 2009， 129（3）： 312-315. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2008.12.011.
[10] 龙强， 聂乾忠， 刘成国. 发酵肉制品功能性发酵剂研究现状[J]. 食品科学， 2016， 37（17）： 263-269. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201617044.
[11] AMMOR M S， MAYO B. Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as functional starter cultures in dry sausage production： an update[J]. Meat Science， 2007， 76（1）： 138-146. DOI：10.1016/j.meatsci.2006.10.022.
[12] WORAPRAYOTE W， MALILA Y， SORAPUKDEE S， et al. Bacteriocins from lactic acid bacteria and their applications in meat and meat products[J]. Meat Science， 2016， 120： 118-132. DOI：10.1016/j.meatsci.2016.04.004.
[13] LUCKE F K. Utilization of microbes to process and preserve meat[J]. Meat Science， 2000， 56（2）： 105-115. DOI：10.1016/S0309-1740（00）00029-2.
[14] 孔保華， 夏让， 夏秀芳， 等. 直投式发酵剂制备的哈尔滨风干肠在成熟过程中的理化及微生物特性变化[J]. 食品工业科技， 2012， 33（8）： 168-175.
[15] CHEN Qian， LIU Qian， SUN Qinxiu， et al. Flavour formation from hydrolysis of pork sarcoplasmic protein extract by a unique LAB culture isolated from Harbin dry sausage[J]. Meat Science， 2015， 100： 110-117. DOI：10.1016/j.meatsci.2014.10.001. [16] RUIZMOYANO S， MARTIN A， BENITO M J， et al. Application of Lactobacillus fermentum HL57 and Pediococcus acidilactici SP979 as potential probiotics in the manufacture of traditional Iberian
dry-fermented sausages[J]. Food Microbiology， 2011， 28（5）： 839-847. DOI：10.1016/j.fm.2011.01.006.
[17] SIDIRA M， KANDYLIS P， KANELLAKI M， et al. Effect of immobilized Lactobacillus casei on the evolution of flavor compounds in probiotic dry-fermented sausages during ripening[J]. Meat Science， 2015， 100： 41-51. DOI：10.1016/j.meatsci.2014.09.011.
[18] 潘晓倩， 成晓瑜， 张顺亮， 等. 腌腊肉制品中乳酸菌的筛选鉴定及其在腊肠中的应用[J]. 食品科学， 2017， 38（16）： 57-63. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201716009.
[19] GOMEZ A H， HU G， WANG J， et al. Evaluation of tomato maturity by electronic nose[J]. Computers and Electronics in Agriculture， 2006， 54（1）： 44-52. DOI：10.1016/j.compag.2006.07.002.
[20] VELI G， ERSEL O， LEVENT A. Effects of packaging method and storage time on the chemical， microbiological， and sensory properties of Turkish pastirma-a dry cured beef product[J]. Meat Science， 2008， 80（2）： 335-344. DOI：10.1016/j.meatsci.2007.12.017.
[21] LIMBO S， TORRI L， SINELLI N， et al. Evaluation and predictive modeling of shelf life of minced beef stored in high-oxygen modified atmosphere packaging at different temperatures[J]. Meat Science， 2010， 84（1）： 129-136. DOI：10.1016/j.meatsci.2009.08.035.
[22] 党亚丽. 金华火腿和巴马火腿风味的研究[D]. 无锡： 江南大学， 2009： 39-40.
[23] 孙宝国. 食用调香术[M]. 北京： 化学工业出版社， 2010： 116-193.
[24] 王海燕. 湖南腊肉源产香葡萄球菌的筛选、鉴定及其产香机理研究[D]. 北京： 中国农业大学， 2005： 7-13.
[25] ANSORENA D， GIMENO O， ASTIASAR?N L， et al. Analysis of volatile compounds by GC-MS of a dry fermented sausage： chorizo de Pamplona[J]. Food Research International， 2001， 34（1）： 67-75. DOI：10.1016/S0963-9969（00）00133-2.
[26] SIDIRA M， KANDYLIS P， KANELLAKI M， et al. Effect of immobilized Lactobacillus casei， on volatile compounds of heat treated probiotic dry-fermented sausages[J]. Food Chemistry， 2015， 178： 201-207. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.01.068.
[27] 王衛， 宋浪， 张佳敏， 等. 腊肠品质形成机理及其调控研究进展[J]. 肉类研究， 2017， 31（5）： 51-54. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201705010.
关键词：乳酸菌；发酵剂；风干肠；风味
Abstract： Lactobacillus plantarum 10M-7， a lactic acid bacterium isolated from naturally fermented traditional cured meat product， was used as a starter culture to produce air-dried sausage. Naturally fermented sausages were used as a control to assess the effect of inoculation with Lactobacillus plantarum on the flavor quality of air-dried sausage. The results showed that the pH value decreased rapidly during the early stage of lactic acid bacterial fermentation and its final value was apparently lower than that of the control. The experimental and control groups exhibited high variability in flavor quality as detected by an electronic nose. gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） analysis indicated that the relative contents of alcohols， ketones and acids in the experimental group were higher than in the control group. In the meantime， the types and relative contents of characteristic aroma compounds identified in the experimental group such as 3-hydroxy-2-butanone， butyric acid ethyl ester， 2-heptanone and 2-nonanone were higher. To conclude， addition of the starter culture could improve the flavor quality and overall acceptance of air-dried sausage.
Key words： lactic acid bacteria； starter culture； air-dried sausage； flavor
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712009
中圖分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）12-0050-06
引文格式：
潘晓倩， 成晓瑜， 张顺亮， 等. 乳酸菌发酵剂对风干肠风味品质的影响[J]. 肉类研究， 2017， 31（12）： 50-55. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712009. http：//www.rlyj.pub
PAN Xiaoqian， CHENG Xiaoyu， ZHANG Shunliang， et al. Effects of lactic acid bacteria starter culture on the flavor quality of air-dried sausage[J]. Meat Research， 2017， 31（12）： 50-55. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712009. http：//www.rlyj.pub
风干香肠具有pH值低、含水量低和含盐量高的特点，属于我国北方地区传统发酵肉制品的一种，其耐贮藏、营养价值高，具有广阔的市场空间[1]。风干香肠的传统制作工艺多采用自然发酵，产品质量不稳定、生产周期长且杂菌的生长容易产生毒素，造成食品安全隐患[2]。近年来，很多企业将自然风干成熟工艺改为高温烘烤，这样虽然避免了传统工艺制作的某些缺点，但产品风味质量大大降低[3]。因此，如何使风干香肠在工业化生产中保持其原有的独特风味是目前人们关注的焦点。自然发酵肉制品风味的产生主要依靠内源酶及特定有益微生物的生长代谢作用[4-5]。对于不添加任何香料的风干香肠的研究发现，其挥发性风味物质中有27%来源于微生物发酵[6]，这也体现出微生物发酵在风干香肠风味形成过程中的重要作用。利用现代微生物技术制作肉用发酵剂是实现我国传统发酵肉制品工业化生产的关键[7-8]。 美国在20世纪30年代就报道了发酵剂在香肠制作中的应用，目前人工发酵肉制品的生产工艺及技术在一些欧美国家已经相当成熟，产品有着广阔的消费市场[9-10]。
乳酸菌是肉制品加工中常用的发酵剂菌种[11]，它能进行糖发酵产生乳酸，降低产品pH值或产生细菌素类物质，从而抑制腐败菌和致病菌的生长繁殖和细菌毒素的
产生[12-13]。同时，发酵过程中乳酸菌能够利用一些水解酶类（脂肪酶、蛋白酶）促进肉类中蛋白质和脂肪的分解，改善产品的组织质构，提高肉制品的消化吸收率[14-15]。
此外，发酵过程中形成的醛、酮、醇、羧酸等一系列风味物质和风味前体物质赋予肉制品特殊的发酵风味，大大改善了其风味品质[16-17]。
本研究利用从自然发酵的传统腌腊肉制品中分离纯化出的1 株植物乳杆菌（植物乳杆菌10M-7）制成干粉发酵剂[18]，并将其应用于风干肠的制作，测定不同加工时期的pH值变化，并用电子鼻传感器和固相微萃取-气相色谱-质谱（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法比较添加乳酸菌制作的风干肠与传统方法制作的风干肠的风味组成与变化，旨在为风干肠工业化生产新技术的进一步优化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪后腿肉（瘦肉）、猪背脂 北京中瑞食品有限公司；食盐、白砂糖、曲酒、味精、香辛料 市售。
实验用乳酸菌菌株为本实验室从自然发酵的传统腌腊肉制品中分离纯化出的1 株植物乳杆菌（植物乳杆菌10M-7），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11341。
1.2 仪器与设备
WH82绞肉机 德国Seydelmann公司；OSCAR20真空灌肠机 德国海因里希弗雷机械制造有限公司；HWS-150恒温恒湿箱 上海森信实验仪器有限公司；BSA822-CW电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PEN3便携式电子鼻传感器 德国Airsense公司；75 ?m二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）固相微萃取针、DB-Wax GC毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 ?m） 美国J&W公司；TRACE 1310-TSQ 8000 GC-MS仪 美国Thermo公司。
1.3 方法
1.3.1 风干肠的加工
风干肠的加工工艺：脂肪切丁，过夜腌制（加食盐）→原料肉（剔除结缔组织等）→绞肉（瘦肉与脂肪均使用8 mm孔径孔板）→加入调味料和发酵剂搅拌→胶原蛋白肠衣灌制→发酵（温度23 ℃，相对湿度80%，时间24 h）→风干成熟（温度10 ℃，相对湿度80%）→成品
风干肠的配方：猪瘦肉80 g、猪背脂20 g、食盐2.0%、白砂糖1.0%、曲酒1.0%、味精0.2%、香辛料0.5%、异抗坏血酸钠0.1%（均为在原料肉中的质量分数）。
将植物乳杆菌10M-7制成干粉发酵剂，其活力为4.75×1010 CFU/g[18]。乳酸菌发酵剂的添加量为
104 CFU/g。对照组为采用未添加任何发酵剂的传统方法制作的风干肠。
1.3.2 pH值测定
分别取风干肠加工第0、1、4、7、12天样品的不同部位若干块，混合后均质，用pH计测定其pH值，每组样品平行测定6 次。
1.3.3 电子鼻分析
PEN3型电子鼻具有10 种金属氧化物半导体型（metal oxide semiconductor，MOS）化学传感元件，每种化学传感器对应的敏感物质类型不同（表1）。乳酸菌发酵剂菌株在肠体内繁殖并生成各种代谢产物，进而对风干肠中风味物质的种类和含量产生影响，在传感器上呈现不同的气味感应信号[19]。
样品制备：准确称取成熟第12天的风干肠样品2 g，切碎，置于10 mL样品瓶中密封，室温环境下平衡2 h，用PEN3型便携式电子鼻传感器对样品进行检测。传感器响应信号在60 s后基本稳定，分析的时间点宜选取在响应稳定的时间范围内，本研究选取70 s处作为信号采集时间点。每组样品平行测定6 次。
1.3.4 样品的SPME
称取成熟第12天的风干肠样品5.00 g，切碎，装入20 mL的SPME顶空中，旋紧盖子，置于50 ℃恒温水浴锅中平衡30 min，然后将经过老化处理的SPME针头插入瓶中，保持纤维头处于顶空状态，吸附40 min。
1.3.5 GC-MS条件
参照张根生等[1]的方法，并略作修改。
GC条件：DB-Wax极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：进样口温度230 ℃，起始柱温40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升至200 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率升至230 ℃，保持3 min；采用不分流进样模式；载气为高纯氦气（纯度>99.99%），流速1.0 mL/min（恒定）。
MS条件：传输线温度230 ℃；離子源温度280 ℃；质量扫描范围40～600 u。
风味组分的GC-MS检测结果通过计算机检索，选取匹配度和反匹配度均大于800的化合物进行定性分析，并根据面积归一化法计算各挥发性化合物的相对含量。
1.3.6 感官评价
将风干肠蒸煮20 min后切片，每片厚度约为0.5 cm。随机邀请15 位专业人员组成评定小组，采用双盲法对产品的色泽、风味、口感、酸味及整体可接受性进行评价，各项指标的最高得分为7 分，最低为1 分。评分标准如表2所示[20]。 1.4 数据处理
电子鼻测定结果利用其配套的Winmuster软件对数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）；采用Excel 2007软件进行数据整理、统计和制图；采用SPSS 17.0软件对数据进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 风干肠加工过程中的pH值变化
由图1可知，未添加乳酸菌发酵剂的传统风干肠在整个加工过程中pH值略有下降（由5.87降至5.72），这可能是由于传统风干肠中天然存在的少量乳酸菌的生长产酸与内源酶降解蛋白质产生非蛋白氮的综合作用[14]。添加乳酸菌发酵剂的风干肠成熟0～1 d时的pH值下降缓慢，这可能是由于发酵剂干粉在肠体中需要一段时间的适应增殖过程；成熟1～7 d时，乳酸菌大量繁殖产酸，导致产品pH值迅速下降（由5.75降至5.32）；成熟后期（7～12 d），风干肠的pH值降幅变缓，这主要是由于产品的水分活度随风干过程的进行而迅速降低，抑制了乳酸菌的繁殖。
对采用2 种制作方法制成的风干肠进行电子鼻检测，采用PCA建立2 组产品制作完成后（即成熟第12天）的响应模型。由图2可知，主成分1和主成分2的贡献率分别为65.88%和29.42%，总贡献率为95.30%，大于90%；2 组产品的数据点均分布在各自区域内，没有重合，表明2 个主成分基本代表了所测样品的主要信息特征，且采用PCA方法能够区分出加入乳酸菌发酵剂后风味有所改变的产品。当组间判别指数高于80%时，说明组间区分明显[21]，对照组与添加乳酸菌发酵剂的实验组产品间的判别指数为97%，表明2 组产品的风味具有明显差异。
2.3 风干肠加工过程中的挥发性风味物质分析
由表3～4可知，生产结束时，对照组和实验组风干肠中均检测出62 种挥发性化合物，其中，添加发酵剂的风干肠中醇类、酮类和酸类物质的相对含量分别为15.20%、8.46%和12.19%，明显高于对照组；而对照组风干肠中烃类物质的相对含量为44.69%，明显高于实验组；对照组风干肠的醛类和酯类化合物的相对含量分别为3.10%和14.75%，略高于实验组的2.41%和12.37%。
对于检出的醇类化合物，实验组风干肠中芳樟醇和2，3-丁二醇的相对含量较高。芳樟醇是重要的呈味萜类物质，主要来源于香辛料，随着发酵的进行，其含量可能发生改变[1]。2，3-丁二醇是金华火腿等多种腌腊肉制品中的特征风味物质，可能来自于微生物的作用，但也有研究称由于2，3-丁二醇沸点较高（179～182 ℃），因此其对肉制品的整体风味贡献不大[22]。
在检出的酮类化合物中，3-羟基-2-丁酮在2 组产品中的相对含量差异较大（实验组为7.35%，对照组为1.95%），3-羟基-2-丁酮带有甜香、乳制品香，且具有脂肪的油腻气味[23]；实验组中2-庚酮和2-壬酮的相对含量分别为0.42%和0.19%，而这2 种物质在对照组中未检出，2-庚酮具有香蕉、奶酪及轻微的药香，2-壬酮带有果香、甜香、蜡香和皂香等气味[23]。酮类物质主要来源于内源酶和微生物作用下游离脂肪酸的不完全β氧化和氨基酸类物质的降解，在腌腊肉制品中起到增强风味的作用，且不同微生物菌株生成酮类物质的能力也有所差异[24]。
实验组风干肠中酸类物质的种类和相对含量均高于对照组，这与加工过程中产品pH值的变化规律相符，主要与乳酸菌的生长繁殖及代谢产酸有关。实验组风干肠中含量较高的主要是乙酸、戊酸和异戊酸，异戊酸稀释后具有干酪、乳制品和水果香气[23]。
对照组风干肠中醛类物质的相对含量略高于实验组，主要包括庚醛、壬醛等。醛类物质阈值较低，是腌腊肉制品中重要的风味物质，主要来自于油酸、亚油酸及亚麻酸等不饱和脂肪酸的氧化作用，常具有清香、果香和脂香[22-23]。
对于检出的酯类化合物，实验组风干肠中乙酸乙酯、异戊酸乙酯的相对含量分别为3.74%和2.03%，明显高于对照组；对照组风干肠中邻苯二甲酸二丁酯的相对含量为6.35%，而实验组未检出。乙酸乙酯是腌腊肉制品典型特征风味的来源之一，具有醚香、果香，同时还有酒样味道[23]，其来自于酸和醇的酯化反应。Ansorena[25]、Sidira[26]等的研究表明，由微生物生长代谢产生的酯类物质中乙酸乙酯含量最高，且乳酸菌发酵碳水化合物生成的多种酸类物质是形成酯类物质的前体。
2 组产品中均有大量烃类物质检出，一般饱和烃类物质阈值较高，对肉制品风味贡献不大，而柠檬烯等萜烯类风味成分主要来自于香辛料，且在风干肠制作过程中含量有所增加，使风干肠的风味更加和谐[1]。
综上所述，乳酸菌发酵剂的添加能够影响风干肠中风味物质的形成，在成熟过程中，风味物质的种类和相对含量均有不同程度的变化，这可能是由于乳酸菌代谢造成乳酸等物质的积累和pH值的下降，促进蛋白质降解，改变了风干肠中的微生物菌群结构，影响脂肪氧化和氨基酸降解等生化反应，进而影响风干肠最终风味物质的形成[27]。
2.4 风干肠的感官评价
由表5可知，实验组风干肠的风味、口感、酸味和整体可接受性均优于对照组，其中酸味和整体可接受性2 项指标的评分显著高于对照组（P<0.05）。乳酸菌发酵糖类物质产生乳酸，降低产品的pH值，当pH值接近肌肉蛋白的等电点（pI=5.4）时，肌肉蛋白易形成胶状组织，黏着力增强，肉制品的弹性和口感均有所提高[14]。自然发酵的腌腊肉制品中适当的酸味能促进产品风味的形成，但过酸则会降低产品的风味品质。本研究中，大多数评定人员能够接受添加发酵剂制作的风干肠特有的发酵酸味，认为其酸味柔和，香味浓郁。
3 结 论
将本实验室分离筛选的1 株乳酸菌（植物乳杆菌10M-7）制成干粉发酵剂生产风干肠，以未添加发酵剂的自然发酵风干肠作为对照。结果表明，实验组风干肠加工初期的pH值迅速下降，且风干成熟后，其pH值明顯低于对照组，这能够提高产品的食用安全性和可贮藏性；电子鼻分析结果表明，添加乳酸菌发酵剂的实验组风干肠的风味与对照组存在明显差异；GC-MS分析结果表明，乳酸菌发酵剂的添加能够有效促进风干肠产品中醇类、酮类和酸类物质相对含量的提高，且实验组风干肠中检出的腌腊肉制品呈香特征物质种类较多，相对含量较高，如3-羟基-2-丁酮、乙酸乙酯、2-庚酮和2-壬酮。感官评价结果表明，添加乳酸菌发酵剂能够改善和提高风干肠的风味，产品的整体可接受性优于对照组，说明该乳酸菌发酵剂适宜在风干肠产品中使用。本研究为风干肠产品的工业化生产和复合发酵剂的开发提供了参考。 参考文献：
[1] 张根生， 程健博， 岳晓霞， 等. 花椒对哈尔滨风干肠菌系及其菌系对风味的影响[J]. 食品科学， 2017， 38（8）： 184-190. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201708029.
[2] 张文龙. 自然发酵北方风干香肠主要微生物分离及纯菌接种发酵工艺研究[D]. 哈尔滨： 哈尔滨工业大学， 2012： 1-2.
[3] 王虎虎， 刘登勇， 徐幸莲， 等. 我国传统腌腊肉制品产业现状及发展趋势[J]. 肉类研究， 2013， 27（9）： 36-40.
[4] WANG X H， REN H Y， LIU D Y， et al. Effects of inoculating Lactobacillus sakei， starter cultures on the microbiological quality and nitrite depletion of Chinese fermented sausages[J]. Food Control， 2013， 32（2）： 591-596. DOI：10.1016/j.foodcont.2013.01.050.
[5] FERREIRA V， BARBOSA J， VENDEIRO S M， et al. Chemical and microbiological characterization of alheira： a typical Portuguese fermented sausage with particular reference to factors relating to food safety[J]. Meat Science， 2006， 4（3）： 570-575.
[6] BERDAGUE J L， MONTEIL P， MONTEIL M C， et al. Effects of starter cultures on the formation of flavour compounds in dry sausage[J]. Meat Science， 1993， 35（3）： 275-287. DOI：10.1016/0309-1740（93）90033-E.
[7] 符小燕， 郭善广， 蒋爱民， 等. 葡萄球菌和乳酸菌对广式腊肠风味的影响[J]. 肉类研究， 2009， 23（9）： 19-24.
[8] 韩建春. 微生物在风干肠中作用机理的研究及应用[D]. 哈尔滨： 东北农业大学， 2000： 3-15.
[9] LUXANANIL P， PROMCHAI R， WANASEN S， et al. Monitoring Lactobacillus plantarum BCC 9546 starter culture during fermentation of Nham， a traditional Thai port sausage[J]. International Journal of Food Microbiology， 2009， 129（3）： 312-315. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2008.12.011.
[10] 龙强， 聂乾忠， 刘成国. 发酵肉制品功能性发酵剂研究现状[J]. 食品科学， 2016， 37（17）： 263-269. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201617044.
[11] AMMOR M S， MAYO B. Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as functional starter cultures in dry sausage production： an update[J]. Meat Science， 2007， 76（1）： 138-146. DOI：10.1016/j.meatsci.2006.10.022.
[12] WORAPRAYOTE W， MALILA Y， SORAPUKDEE S， et al. Bacteriocins from lactic acid bacteria and their applications in meat and meat products[J]. Meat Science， 2016， 120： 118-132. DOI：10.1016/j.meatsci.2016.04.004.
[13] LUCKE F K. Utilization of microbes to process and preserve meat[J]. Meat Science， 2000， 56（2）： 105-115. DOI：10.1016/S0309-1740（00）00029-2.
[14] 孔保華， 夏让， 夏秀芳， 等. 直投式发酵剂制备的哈尔滨风干肠在成熟过程中的理化及微生物特性变化[J]. 食品工业科技， 2012， 33（8）： 168-175.
[15] CHEN Qian， LIU Qian， SUN Qinxiu， et al. Flavour formation from hydrolysis of pork sarcoplasmic protein extract by a unique LAB culture isolated from Harbin dry sausage[J]. Meat Science， 2015， 100： 110-117. DOI：10.1016/j.meatsci.2014.10.001. [16] RUIZMOYANO S， MARTIN A， BENITO M J， et al. Application of Lactobacillus fermentum HL57 and Pediococcus acidilactici SP979 as potential probiotics in the manufacture of traditional Iberian
dry-fermented sausages[J]. Food Microbiology， 2011， 28（5）： 839-847. DOI：10.1016/j.fm.2011.01.006.
[17] SIDIRA M， KANDYLIS P， KANELLAKI M， et al. Effect of immobilized Lactobacillus casei on the evolution of flavor compounds in probiotic dry-fermented sausages during ripening[J]. Meat Science， 2015， 100： 41-51. DOI：10.1016/j.meatsci.2014.09.011.
[18] 潘晓倩， 成晓瑜， 张顺亮， 等. 腌腊肉制品中乳酸菌的筛选鉴定及其在腊肠中的应用[J]. 食品科学， 2017， 38（16）： 57-63. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201716009.
[19] GOMEZ A H， HU G， WANG J， et al. Evaluation of tomato maturity by electronic nose[J]. Computers and Electronics in Agriculture， 2006， 54（1）： 44-52. DOI：10.1016/j.compag.2006.07.002.
[20] VELI G， ERSEL O， LEVENT A. Effects of packaging method and storage time on the chemical， microbiological， and sensory properties of Turkish pastirma-a dry cured beef product[J]. Meat Science， 2008， 80（2）： 335-344. DOI：10.1016/j.meatsci.2007.12.017.
[21] LIMBO S， TORRI L， SINELLI N， et al. Evaluation and predictive modeling of shelf life of minced beef stored in high-oxygen modified atmosphere packaging at different temperatures[J]. Meat Science， 2010， 84（1）： 129-136. DOI：10.1016/j.meatsci.2009.08.035.
[22] 党亚丽. 金华火腿和巴马火腿风味的研究[D]. 无锡： 江南大学， 2009： 39-40.
[23] 孙宝国. 食用调香术[M]. 北京： 化学工业出版社， 2010： 116-193.
[24] 王海燕. 湖南腊肉源产香葡萄球菌的筛选、鉴定及其产香机理研究[D]. 北京： 中国农业大学， 2005： 7-13.
[25] ANSORENA D， GIMENO O， ASTIASAR?N L， et al. Analysis of volatile compounds by GC-MS of a dry fermented sausage： chorizo de Pamplona[J]. Food Research International， 2001， 34（1）： 67-75. DOI：10.1016/S0963-9969（00）00133-2.
[26] SIDIRA M， KANDYLIS P， KANELLAKI M， et al. Effect of immobilized Lactobacillus casei， on volatile compounds of heat treated probiotic dry-fermented sausages[J]. Food Chemistry， 2015， 178： 201-207. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.01.068.
[27] 王衛， 宋浪， 张佳敏， 等. 腊肠品质形成机理及其调控研究进展[J]. 肉类研究， 2017， 31（5）： 51-54. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201705010.