【摘 要】
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目的构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因与EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因LMP2A融合基因的原核表达载体。方法用随机引物Oligo(dT)15进行RT-PCR,分别获得人GM-CSF和L
【机 构】
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济宁医学院病原生物学教研室,医学免疫学省级重点学科,
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目的构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因与EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因LMP2A融合基因的原核表达载体。方法用随机引物Oligo(dT)15进行RT-PCR,分别获得人GM-CSF和LMP2A编码序列的cDNA。将纯化GM-CSF和EB病毒LMP2APCR扩增产物插入高效克隆载体pMD18-T,并转化入感受态细胞Esche-richia coli DH10B,在含有x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基平板上进行蓝白斑选择,测序正确的序列进行剪接式重叠延伸,将目的基因GM-CSF和LMP2A编码经多肽接头(Gly4Ser)3序列连接,构建融合基因GC2A,将GC2A克隆至pMD18-T,转化感受态细胞E.coliDH10B,在含有x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基平板上进行蓝白斑选择。结果目的基因GM-CSF和LMP2ART-PCR产物大小分别为470bp和1 545bp,与预期值一致。构建的重组质粒经双酶切、扩增及测序鉴定证实,融合基因(1 961bp)正确插入载体。结论融合基因正确插入pMD18-T,并成功转化入感受态细胞E.coli DH10B,为进一步研究奠定了基础。
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