【摘 要】
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为开展猪轮状病毒(PRV)及其VP4蛋白相关特性研究,参照Gen Bank所收录的猪轮状病毒JL94、OSU等株序列设计一对特异性引物,从实验室分离鉴定的猪轮状病毒DN30209株扩增约2 330
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(31300758;31340003);“十二五”国家科技支撑项目(2013BAD12B04);哈尔滨科学技术局项目(RC2012XK002003);中国教育部重点项目(212038)
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为开展猪轮状病毒(PRV)及其VP4蛋白相关特性研究,参照Gen Bank所收录的猪轮状病毒JL94、OSU等株序列设计一对特异性引物,从实验室分离鉴定的猪轮状病毒DN30209株扩增约2 330 bp VP4全长基因,并成功构建重组质粒VP4-p MD18-T。重组质粒经测序、序列比对及分析。结果表明,DN30209株VP4全基因长2331 bp,与参考株JL94的核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.5%。将VP4基因连接到p GEX-6P-1原核表达载体中,构建并筛选出阳性原核表达载体重组质粒VP4-p GEX-6P-1。阳性重组质粒转化Rosetta宿主菌感受态细胞中,经IPTG诱导,获得以包涵体形式表达的重组蛋白,融合蛋白大小约为112 ku,与预期大小相符。回收、纯化并复性该蛋白,将其作为免疫原免疫大白兔,制备兔抗PRV VP4全长蛋白多克隆抗体,间接ELISA测定多抗效价到1:105,间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)检测表明该多抗均可与PRV具有很好的抗原抗体反应性,为猪轮状病毒研究提供有效实验材料。
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