论文部分内容阅读
摘 要：为了确定石榴冠瘿病的病原菌，对新疆喀什地区疏附县石榴冠瘿病的发生危害进行了调查。通过采用病原菌分离、鉴定，并通过快速接种番茄诱导使根茎产生肿瘤等方法，明确了石榴冠瘿病的病原菌为Agrobacterium tumefaciens（Smith and Townsend）Conn.。石榴冠瘿病是国内新发生的病害，应该严格检疫。
关键词：石榴；冠瘿病；病原菌
中图分类号：S665.4；S436.6 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.06.015
果树冠瘿病（Crown gall disease）又称根癌病、根瘤病，是多种果树共患的一种重要的根部病害。陕西、山西、甘肃、辽宁、河北等省（区）都有分布，寄主范围广泛，主要包括李属、蔷薇属、苹果属、梨属、胡桃属、葡萄属等331属的640个不同种植物。感病植物根系出现瘤状癌变，地上部分生长缓慢，枝条干枯甚至枯死，对苗木和幼树影响很大[1-6]。近年来，由于果树、经济林木等栽培业迅速发展，苗木调运频繁，此病在新疆有继续发展扩大蔓延的趋势，是一种急需控制的危险性病害[7]。
冠瘿病是一种细菌性病害。德国科学家经过多年研究发现了冠瘿病的成病机理。冠瘿病是一种由根瘤农杆菌引起的在多种植物中广泛传播的病害，患病植物的一些部位，尤其是根茎接合部形成肿瘤状膨大，造成果树减产[8]。据我们调查，在2009年喀什地区疏附县石榴种植区发生了石榴冠瘿病。经查阅文献，在我国还无人对石榴冠瘿病进行过研究的报道，为此我们于2010年5—10月和2011年5—10月对喀什石榴冠瘿病病害的发生危害情况及对病原菌进行了分离培养鉴定，为病害的有效治理提供科学基础。
1 材料和方法
1.1 果园石榴冠瘿病发病率调查
2010年5—10月、2011年5—10月连续2年，对新疆喀什地区疏附县石榴基地冠瘿病发生情况，进行了专项调查。
1.2 病原菌的分离、培养、鉴定
1.2.1 供试培养基 PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基。PDA培养基的成分：马铃薯200 g，葡萄糖10～20 g，琼脂17～20 g，水1 000 mL。牛肉膏蛋白胨培养基的成分：牛肉膏5 g，氯化钠5 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，琼脂15 g，水1 000 mL。
1.2.2 分离方法 从果园发病的果树枝条瘤状物处，刮去表皮角质层，留取木质部以上瘤状皮层和木质部，切取至绿豆大小。经处理后的病样通过以下程序消毒灭菌：75%酒精浸泡5～10 s，取出置5%次氯酸钠溶液浸泡2 min后，依次在无菌水中清洗3，5，3 min。捣碎皮层组织和木质部，分别划线接种于PDA和牛肉膏蛋白胨培养基上，25 ℃培养3 d后纯化，观察其培养特性，再进行革兰氏染色。
1.2.3 纯化及革兰氏染色[9] 将培养出的病原菌接种至铺好的培养皿中，倒扣放置。待接种程序完成后，把接种好的培养皿放置于25 ℃下的温箱中培养，3 d后开始记录生长菌落。将生长出的病原菌涂片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。草酸铵结晶紫染1 min。自来水冲洗，去掉浮色。用碘-碘化钾溶液媒染1 min，倾去多余溶液。用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30 s，油镜观察。
1.2.4 病原菌的致病性测定 选用番茄做为指示植物。在室内条件下，用番茄消毒种子培养苗长到8 cm高时，采用根茎注射的方法用灭菌注射器接种病菌悬液，以接无菌水为对照，共接种20株，每株3个接种点，套袋保湿培养24 h后去掉保鲜袋。第3天开始观察记录，10 d后统计肿瘤发生情况。参考细菌鉴定方面的资料，结合接种诱导对病原菌进行鉴定[10]。
2 结果与分析
2.1 症状描述
石榴冠瘿病主要危害枝条、根茎部等。在危害部位形成大小不一的瘤状物，初期幼嫩，质地柔软，逐渐增大成不规则形状，其后在大瘤上又出现许多小瘤，表面粗糙并龟裂，颜色发绿，到后期瘤的内部组织紊乱，瘤边缘长出许多丝状物（图1）；得病后的植株生长衰弱，叶黄而且小，新梢生长不良，甚至枯死（图2）
2.2 病原菌的分离鉴定
分别用牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基用稀释分离法培养[11]，在牛肉膏蛋白胨培养基上主要长出细菌菌落，5个培养皿上共长出650个菌落。在皮层组织中分离出607个菌落；木质部和表皮很少，共分离出43个菌落。根据菌落特征将其归为2种：但以菌株1为优势细菌，在牛肉膏蛋白胨培养基上，菌落小而圆，白色，稍突起，湿润半透明，菌体杆状，平均大小0.6×2.0 μm，革兰氏染色反应阴性。结果见表1。
2.3 病原细菌的致病性测定
将石榴枝条瘤状物上分离纯化后的菌株1，接种到8 cm高的盆栽番茄幼苗根茎上，诱发肿瘤迅速形成，再从诱发的肿瘤上分离出与原先接种的相同菌。结果见表2。接种组与对照组有较明显的差异。
3 结论与讨论
通过对石榴冠瘿病的症状观察，病原分离培养，接种诱导相结合的方法，确定引起新疆喀什地区疏附县石榴冠瘿病的病原，是野杆菌属的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens （Smith and Townsend）Conn，与文献报道的果树冠瘿病的致病菌特征相一致。从分离部位来看病，瘤皮层中分离细菌数量多，木质部和表皮很少。
该病原菌在石榴上的危害在全国尚属首次报道，危害性很强，可以导致石榴树干枯，从而造成巨大的经济损失，应该引起高度重视。石榴产地发现病株应立即挖出集中烧毁。无病区不宜从病区引进苗木，调运检疫中发现病苗应该销毁。对可疑苗木出圃时，用硫酸铜浸泡5 min，再用生石灰50倍液浸泡1 min，并用清水冲洗。
对轻度病株可将病瘤切除，用80%抗菌剂402乳油50倍液消毒，外涂波尔多液保护。可以消除病瘤。
参考文献：
[1] Moore L W.Use of Agrobacterium radibacter in agriculture ecosystems[J].Microbiological Sciences，1988，5（3）：92-95.
[2] 段保灵，陈秀玉，何银灵，等.果树冠瘿病的发生规律与综合防治技术[J].河南林业科技，2005，25（1）：55.
[3] 王慧敏.引进生防制剂防治我国果树根癌病Ⅰ[J].北京农业大学学报，1991（1）：91-94.
[4] 唐德志.美国扁桃品种病害发生情况调查[J].中国果树，1997（4）：49-51.
[5] 丁海琴，沈伯军，左春霞，等.如皋市花木冠瘿病的发生与防治[J].江苏林业科技，2005，32（3）：41.
[6] 李百万，柳建定，熊小萍，等.樱花冠瘿病的诊断与防治[J].华东森林经理，2006，20（1）：33-34.
[7] 段保灵，陈秀玉，何银玲，等.果树冠瘿病的发生规律与综合防治技术[J].河南林业科技，2005，25（1）：55.
[8] 班玮.德国研究发现植物冠瘿病发病机理[EB/OL].[2009-11-19].http：//news.xinhuanet.com/tech/2009-11/19/content_12493220.htm.
[9] 刘玉珍.革兰氏（Gram）染色法（Hucker氏改良法）的改进[J].微生物学研究与应用，1990（4）：35.
[10] 李芳莲，朱天辉.布朗李和白凤桃冠瘿病检测方法[J].四川林业科技，2008，29（1）：47-49.
[11] 蒋萍，潘存德.酸枣冠瘿病在新疆阿克苏的发生危害及病原鉴定[J].新疆农业大学学报，2008，31（5）：20-22.
关键词：石榴；冠瘿病；病原菌
中图分类号：S665.4；S436.6 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.06.015
果树冠瘿病（Crown gall disease）又称根癌病、根瘤病，是多种果树共患的一种重要的根部病害。陕西、山西、甘肃、辽宁、河北等省（区）都有分布，寄主范围广泛，主要包括李属、蔷薇属、苹果属、梨属、胡桃属、葡萄属等331属的640个不同种植物。感病植物根系出现瘤状癌变，地上部分生长缓慢，枝条干枯甚至枯死，对苗木和幼树影响很大[1-6]。近年来，由于果树、经济林木等栽培业迅速发展，苗木调运频繁，此病在新疆有继续发展扩大蔓延的趋势，是一种急需控制的危险性病害[7]。
冠瘿病是一种细菌性病害。德国科学家经过多年研究发现了冠瘿病的成病机理。冠瘿病是一种由根瘤农杆菌引起的在多种植物中广泛传播的病害，患病植物的一些部位，尤其是根茎接合部形成肿瘤状膨大，造成果树减产[8]。据我们调查，在2009年喀什地区疏附县石榴种植区发生了石榴冠瘿病。经查阅文献，在我国还无人对石榴冠瘿病进行过研究的报道，为此我们于2010年5—10月和2011年5—10月对喀什石榴冠瘿病病害的发生危害情况及对病原菌进行了分离培养鉴定，为病害的有效治理提供科学基础。
1 材料和方法
1.1 果园石榴冠瘿病发病率调查
2010年5—10月、2011年5—10月连续2年，对新疆喀什地区疏附县石榴基地冠瘿病发生情况，进行了专项调查。
1.2 病原菌的分离、培养、鉴定
1.2.1 供试培养基 PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基。PDA培养基的成分：马铃薯200 g，葡萄糖10～20 g，琼脂17～20 g，水1 000 mL。牛肉膏蛋白胨培养基的成分：牛肉膏5 g，氯化钠5 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，琼脂15 g，水1 000 mL。
1.2.2 分离方法 从果园发病的果树枝条瘤状物处，刮去表皮角质层，留取木质部以上瘤状皮层和木质部，切取至绿豆大小。经处理后的病样通过以下程序消毒灭菌：75%酒精浸泡5～10 s，取出置5%次氯酸钠溶液浸泡2 min后，依次在无菌水中清洗3，5，3 min。捣碎皮层组织和木质部，分别划线接种于PDA和牛肉膏蛋白胨培养基上，25 ℃培养3 d后纯化，观察其培养特性，再进行革兰氏染色。
1.2.3 纯化及革兰氏染色[9] 将培养出的病原菌接种至铺好的培养皿中，倒扣放置。待接种程序完成后，把接种好的培养皿放置于25 ℃下的温箱中培养，3 d后开始记录生长菌落。将生长出的病原菌涂片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。草酸铵结晶紫染1 min。自来水冲洗，去掉浮色。用碘-碘化钾溶液媒染1 min，倾去多余溶液。用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30 s，油镜观察。
1.2.4 病原菌的致病性测定 选用番茄做为指示植物。在室内条件下，用番茄消毒种子培养苗长到8 cm高时，采用根茎注射的方法用灭菌注射器接种病菌悬液，以接无菌水为对照，共接种20株，每株3个接种点，套袋保湿培养24 h后去掉保鲜袋。第3天开始观察记录，10 d后统计肿瘤发生情况。参考细菌鉴定方面的资料，结合接种诱导对病原菌进行鉴定[10]。
2 结果与分析
2.1 症状描述
石榴冠瘿病主要危害枝条、根茎部等。在危害部位形成大小不一的瘤状物，初期幼嫩，质地柔软，逐渐增大成不规则形状，其后在大瘤上又出现许多小瘤，表面粗糙并龟裂，颜色发绿，到后期瘤的内部组织紊乱，瘤边缘长出许多丝状物（图1）；得病后的植株生长衰弱，叶黄而且小，新梢生长不良，甚至枯死（图2）
2.2 病原菌的分离鉴定
分别用牛肉膏蛋白胨培养基和PDA培养基用稀释分离法培养[11]，在牛肉膏蛋白胨培养基上主要长出细菌菌落，5个培养皿上共长出650个菌落。在皮层组织中分离出607个菌落；木质部和表皮很少，共分离出43个菌落。根据菌落特征将其归为2种：但以菌株1为优势细菌，在牛肉膏蛋白胨培养基上，菌落小而圆，白色，稍突起，湿润半透明，菌体杆状，平均大小0.6×2.0 μm，革兰氏染色反应阴性。结果见表1。
2.3 病原细菌的致病性测定
将石榴枝条瘤状物上分离纯化后的菌株1，接种到8 cm高的盆栽番茄幼苗根茎上，诱发肿瘤迅速形成，再从诱发的肿瘤上分离出与原先接种的相同菌。结果见表2。接种组与对照组有较明显的差异。
3 结论与讨论
通过对石榴冠瘿病的症状观察，病原分离培养，接种诱导相结合的方法，确定引起新疆喀什地区疏附县石榴冠瘿病的病原，是野杆菌属的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens （Smith and Townsend）Conn，与文献报道的果树冠瘿病的致病菌特征相一致。从分离部位来看病，瘤皮层中分离细菌数量多，木质部和表皮很少。
该病原菌在石榴上的危害在全国尚属首次报道，危害性很强，可以导致石榴树干枯，从而造成巨大的经济损失，应该引起高度重视。石榴产地发现病株应立即挖出集中烧毁。无病区不宜从病区引进苗木，调运检疫中发现病苗应该销毁。对可疑苗木出圃时，用硫酸铜浸泡5 min，再用生石灰50倍液浸泡1 min，并用清水冲洗。
对轻度病株可将病瘤切除，用80%抗菌剂402乳油50倍液消毒，外涂波尔多液保护。可以消除病瘤。
参考文献：
[1] Moore L W.Use of Agrobacterium radibacter in agriculture ecosystems[J].Microbiological Sciences，1988，5（3）：92-95.
[2] 段保灵，陈秀玉，何银灵，等.果树冠瘿病的发生规律与综合防治技术[J].河南林业科技，2005，25（1）：55.
[3] 王慧敏.引进生防制剂防治我国果树根癌病Ⅰ[J].北京农业大学学报，1991（1）：91-94.
[4] 唐德志.美国扁桃品种病害发生情况调查[J].中国果树，1997（4）：49-51.
[5] 丁海琴，沈伯军，左春霞，等.如皋市花木冠瘿病的发生与防治[J].江苏林业科技，2005，32（3）：41.
[6] 李百万，柳建定，熊小萍，等.樱花冠瘿病的诊断与防治[J].华东森林经理，2006，20（1）：33-34.
[7] 段保灵，陈秀玉，何银玲，等.果树冠瘿病的发生规律与综合防治技术[J].河南林业科技，2005，25（1）：55.
[8] 班玮.德国研究发现植物冠瘿病发病机理[EB/OL].[2009-11-19].http：//news.xinhuanet.com/tech/2009-11/19/content_12493220.htm.
[9] 刘玉珍.革兰氏（Gram）染色法（Hucker氏改良法）的改进[J].微生物学研究与应用，1990（4）：35.
[10] 李芳莲，朱天辉.布朗李和白凤桃冠瘿病检测方法[J].四川林业科技，2008，29（1）：47-49.
[11] 蒋萍，潘存德.酸枣冠瘿病在新疆阿克苏的发生危害及病原鉴定[J].新疆农业大学学报，2008，31（5）：20-22.