【摘 要】
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利用Red重组系统和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bacmid在E.coli DH10Bac中快速敲除BmNPV极晚期表达因子基因vlf-1,调查对病毒复制的影响,以探究BmNPV vlf-1基因的功能。首先从E
【机 构】
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浙江理工大学生物化学研究所; 浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室;
【基金项目】
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国家高技术研究发展计划“863”项目(No.2011AA1006-03);浙江省自然科学基金项目(No.Y3090339,Y31101-87);浙江省教育厅科技项目(No.Y201019102)
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利用Red重组系统和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bacmid在E.coli DH10Bac中快速敲除BmNPV极晚期表达因子基因vlf-1,调查对病毒复制的影响,以探究BmNPV vlf-1基因的功能。首先从E.coli BW25113中提取能表达Red重组酶的质粒pKD46,将其转化到E.coli DH10Bac中,获得可用于BmNPV基因打靶的DH10Bac(含有质粒pKD46)菌株;再为发生基因同源重组设计一对长60 bp的引物,5’端长40 bp,分别为vlf-1基因的左右同源臂,3’端长20 bp,分别为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列;以含有cat的pKD3质粒为模板,PCR扩增含vlf-1同源臂的cat基因,即打靶线性化片段;将该线性化片段转入DH10Bac(pKD46)菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与Bacmid DNA中的vlf-1基因发生同源重组。利用设计的2对特异性引物PCR验证cat基因替换vlf-1基因操作成功,获得vlf-1缺失型BmNPV。将vlf-1缺失型Bacmid DNA转染BmN细胞,利用qPCR分析vlf-1基因缺失对于病毒复制的影响,结果表明:vlf-1基因缺失对BmNPV起始DNA复制没有明显的影响,但是可能影响之后的病毒装配和侵染。
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