成体干细胞的命运与其生存的微环境密切相关。研究表明，胚胎干细胞(ESCs)微环境能增强人角膜缘干细胞(LSCs)的干性，其作用机制是研究热点。
目的探讨干细胞微环境增强LSCs的干性及其抑制细胞凋亡的分子机制。
方法将129小鼠ES细胞株(E14细胞)分别用CnT-20培养液和CnT-20＋体积分数20%ES(ESC-CM)培养液进行培养和传代。采用新鲜供体人角膜缘组织块培养法，分别用CnT-20培养液和ESC-CM培养液培养和传代LSCs，细胞经固定后于光学显微镜下观察细胞克隆形态并计算克隆形成率(CFE)。ESC-CM培养组细胞分别转染端粒酶逆转录酶(TERT)siRNA(19-25nt siRNA)或siRNA(sc-37007)，流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡、线粒体膜电位的改变；采用免疫荧光技术和流式细胞技术检测siRNA转染前后细胞中端粒酶的表达和活性氧簇(ROS)的产生情况；采用RT-PCR、免疫荧光技术和Western blot法检测细胞中干细胞标志物p63、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)、整合素β1(integrin β1)和细胞分化标志物细胞角蛋白3(CK3)mRNA及其蛋白的表达；采用Western blot法检测细胞中黏着斑激酶(FAK)、Akt和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)及其磷酸化蛋白以及p21蛋白的改变。
结果ESC-CM培养组LSCs可传至第8代，CFE为(7.6±0.6)%，CnT-20培养组传至第6代，CFE为(5.6±0.6)%，差异有统计学意义(t＝4.454，P＝0.011)；ESC-CM培养组第2、3、4、5、6代LSCs的凋亡百分比均明显低于CnT-20培养组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；siRNA-F转染细胞的凋亡率为(7.7±1.3)%，明显低于siRNA-TERT转染细胞的(32.3±3.1)%，差异有统计学意义(t＝－12.588，P＝0.000)。ESC-CM培养组与CnT-20培养组的原代LSCs中干细胞标志物mRNA及其蛋白、TERT蛋白的相对表达量差异均无统计学意义(均P>0.05)，但ESC-CM培养组CK3 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显低于CnT-20培养组，差异均有统计学意义(均P<0.01)；ESC-CM培养组第2代细胞中干细胞标志物蛋白及TERT蛋白表达量均明显高于CnT-20培养组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。siRNA-TERT转染组细胞端粒酶活性为(4.83±0.67)%，明显低于siRNA-F转染组的(46.71±1.22)%，差异有统计学意义(t＝52.116，P＝0.000)。ESC-CM培养组培养液中添加了FAK抑制剂和GSK3β抑制剂以及转染TERT-siRNA后，细胞中pFAK、pAkt、pGSK3β的表达明显减弱，而p21的表达增强。ESC-CM培养组第2代LSCs及siRNA-F转染组细胞的线粒体膜电位明显高于CnT-20培养组和siRNA-TERT转染组，差异均有统计学意义(均P<0.01)；ESC-CM培养组原代和第2代细胞中及siRNA-F转染组细胞中ROS表达比例均明显低于CnT-20培养组及siRNA-TERT转染组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。
结论ESC-CM培养体系可促进LSCs干性的维持，抑制细胞凋亡，其机制可能与端粒酶-p21-线粒体通路及FAK/Wnt信号通路的激活有关。