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摘 要：从浙江省舟山海域潮间带中得到一株产电细菌M2，经过16S rRNA分子鉴定及生理生化试验，初步鉴定该菌为Shewanella属细菌，并命名为Shewanella sp. M2。菌株M2在脱脂奶平板上能产生明显且较大的水解透明圈，通过Folin-酚法进行酶活测定，初始蛋白酶酶活为110 U/mL，对其进行紫外诱变处理，最终得到酶活为205 U/mL的突变株，酶活提高了86.4%，传代试验结果显示该菌株具有较好的遗传稳定性能。
关键词：产电菌；蛋白酶；Folin-酚法；紫外诱变
碱性蛋白酶在环保、丝绸、饲料、洗涤剂、食品、医药等领域广泛应用，生产量可以达到酶制剂总产量的40%，经济价值显著[1]。碱性蛋白酶仍然存在品种单一的问题，酶的活性不高，价格昂贵，优质产酶菌株的筛选和选育有着十分重要的应用价值。Kunamneni Adinarayana[2]等发现一种蛋白酶，将其在60 ℃下保温350 min，研究发现该酶仍保持了100%酶活力。Tsuyoshi Nonaka[3]等研究具有抗氧化性能的蛋白酶生产菌，并将其应用于洗涤行业。Raja等[4]利用盐析及层析方法得到的酶，分子量约为51 000 Da，酶活力提高124倍。如今，在极端环境中发现的碱性蛋白酶已经成为研究的热点[5]。
碱性蛋白酶的高产菌株仍旧集中在枯草杆菌属，来源较为单一，导致目前的蛋白酶结构也较为单一。目前海洋来源的蛋白酶逐渐成为研究热点，由于菌株所处环境的原因，可能生产出具有独特酶学性质与结构的蛋白酶。
本实验室在研究微生物燃料电池过程中发现一株海洋产电菌Shewanella sp. M2[6]，初始輸出电压为75 mV，该菌在脱脂奶平板上产生了非常明显的透明圈，通过酶活检测，初始酶活较高，具有很好的选育价值，而产电菌产蛋白酶的报道则很少见，菌株M2具有很好的潜在研究价值。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 培养基 脱脂奶培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠1.0 g，琼脂20.0 g，pH 值72～7.4，加热溶解于1 000 mL海水中，于121 ℃高压灭菌30 min，备用。脱脂牛奶10.0 g，溶于1 000 mL海水中，于115 ℃灭菌30 min。使用前按照1∶1混匀得到培养基。
发酵培养基[7-8]：①酪蛋白10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO4 2.0 g，人工海水1 000 mL，pH 7.5；②可溶性淀粉40 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，蛋白胨15 g，NaCl 5 g，K2HPO4 3.5 g，NaH2PO4 0.3 g，Na2CO3 0.56 g，人工海水 1 000 mL，调pH 7.5；③蛋白胨5.0 g，酵母膏30 g，葡萄糖5.0 g，人工海水 1 000 mL，pH 75；④牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，脱脂奶10.0 g，人工海水1 000 mL，pH 7.5。
产电基础培养基[9]：NaCl 20.0 g， KCl 0.745 g，NaH2PO4 0.35 g， Na2HPO4 0.44 g， MgSO4 0.188 g，Wolfe 微量元素溶液10 mL，陈海水1 L。
1.1.2 试剂 1 000 μg/mL的标准酪氨酸溶液：将酪氨酸放于100～105 ℃的干燥箱中烘干3 h，冷却后，称取0.1 g溶于10 mL 5 mol/L的盐酸中，再用0.1 mol/L的盐酸稀释100 mL，放置于冰箱中保存。
1.1.3 菌种 菌株Shewanella sp. M2，本实验室筛选鉴定后提供，GenBank登录号为KU865683。
1.1.4 产电装置 利用试剂瓶型的微生物燃料电池测试产电量。首先，将目标菌种在产电液体培养基中培养至对数期，冷冻离心，加入阳极室并加入一定量的产电培养基，阴极加入等量产电基础培养基，测量电压。
1.2 实验方法
1.2.1 平板筛选 将纯化后的菌株M2点种于脱脂奶平板上，25 ℃培养，3 d后取出并观察透明圈的产生。
1.2.2 酶活测定 将斜面保种的菌株分别接种于4种发酵培养基，装量为50 mL/250 mL，控制转速80 r/min，2～3 d后测酶活。
1.2.2.1 标准曲线绘制
根据酪氨酸在紫外波长275 nm下具有特征光吸收的原理，利用紫外分光光度法测定酶促反应后在275 nm下的吸光值，得到反应生成的酪氨酸的量，从而计算酶活。按照表1绘制标准曲线。
1.2.2.2 酶活测定
酶活力定义：以酪蛋白为底物，每分钟水解产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。
发酵液5 000 r/ min进行离心，取上清，进行适度稀释后测酶活，实验过程参照表2，试管号1为空白对照。
U=（A×K×4）/（10×N）
其中U表示酶活，A表示吸光值，K为标准曲线的系数，4表示反应总体积，10表示反应时间，N为稀释倍数。
1.2.3 紫外诱变 挑取纯化后的斜面培养物一环接种于发酵培养基中，25 ℃，80 r/min培养3 d，5 000 r/min离心10 min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，制成一定浓度的菌悬液（OD600=0.5±0.15）进行紫外诱变。
紫外灯开启，照射30 min后，取一定量的菌悬液放入6 cm培养皿中，30 cm垂直照射，先盖盖子1 min，后开盖子，同时进行搅拌（可以灭菌后的大头针代替转子），照射时间控制为30、60、90、120、150及180 s。取在各个时间处理的菌液0.1 mL，并用无菌水稀释至10-3浓度，分别在脱脂奶培养基上进行涂布，每个时间点做3个重复，做空白对照，涂布后于暗处培养2～3 d后观察，选取HC比值较大的测酶活。希望获得酶活明显增加的突变菌株。 1.2.4 传代试验及产电试验 将诱变得到的高产菌株进行遗传稳定试验，转接12代，分别测酶活及产电量。
2 结果与分析
2.1 平板试验结果
菌株M2点种于脱脂奶培养基上，3 d后观察结果如图1所示，HC比值为4.3～4.7。
2.2 酶活的测定
2.2.1 标准曲线 用100 μg/mL的酪氨酸标准溶液配制标准系列溶液，以“0”号管为空白对照，不同含量的酪氨酸的吸光度值结果见表3。
吸光值A为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，绘制结果见图2，得到的回归曲线方程为y=0.009 2 x-0.009 1，R2=0.996 8，R2的值大于0.99，显然该方程具有较好的线性相关性。
2.2.2 不同发酵液的酶活测定 绘制标准曲线后，在1-4号发酵培养基中测到的酶活如下表4所示，结果显示可溶性淀粉培养基作为发酵培养基可以获得较高的酶活，酶活达到110 U/mL。
2.3 紫外诱变结果
紫外线诱变结果显示，在紫外照射时间为90～150 s时候具有较好的观察结果，30 s照射时间导致菌落数太多无法很好观察，照射时间达到180 s时则基本没有菌落生长，最终在照射时间为120 s的平板上，测到HC值为5.8的菌落，进行酶活测定，最终酶活为175 U/mL，相比初始酶活，酶活提高了59.1%，提高显著。对M2突变株进行产电试验，获得的输出电压为105 mV，比初始输出电压75 mV提高了40%。
2.4 遗传稳定性试验
将紫外誘变后的菌株进行遗传稳定性试验，结果如表4所示，在连续传代10代，酶活为160 U/mL，酶活减少8.6%，遗传性较为稳定，12代时酶活降低到130 U/mL，酶活降低25.7%，此时产酶稳定性显著降低。输出电压也在12代时降低到70 mV，减少33.3%，输出电压的能力也明显降低。
3 讨论
在舟山潮间带海域中筛选得到一株产电菌Shewanella sp. M2，脱脂奶平板试验显示其具有产蛋白酶能力，在可溶性淀粉发酵培养基得到最大产酶活性，酶活达到110 U/mL，利用紫外线对菌株进行诱变处理，得到诱变株的酶活为175 U/mL，酶活提高为59.1%，输出电压为105 mV，比初始输出电压提高了40%，遗传稳定性试验显示，在传代到10代以后酶活及输出电压才有降低，连续传代10代的遗传稳定性较高。
为了获得更加稳定而高产的突变菌株，目前诱变育种已经与基因工程进行很好的结合。Wang 等[10]从海洋微生物菌株Pseudomonas sp.中发现OFR编码一组无信号肽的氨基酸，在Escherichia coli 成功进行表达。 Jas min等[11]克隆到海洋来源的碱性蛋白酶基因，尝试构建其三维结构。
产电菌多为厌氧菌和兼性厌氧菌，产电菌产蛋白酶的报道很少，这次研究发现对于深入研究产电菌具有很好的价值。
参考文献：
[1]
Gupta R，Beg QK，Lorenz P.Bacterial alkaline proteases： molecular approaches and industrial applications[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2002，59（1）：15-32
[2] Kunamneni Adinarayana，Poluri Elllaiah，Davuluri Siva Prasad et al.Purification and Partial Characterization of Thermostable Serine Alkaline Protease from a Newly Isolated Bacillus sublitis PE-11[J].AAPS PH armSciTech2003；4（4）： 65-72
[3] Tsuyoshi Nonaka， Masahiro Fujihashi， Akiko Kita， Katsuhisa et al. The crystal structure of an oxdatively- stable subtilisin alkaline serine protease， KP-43， with a C-terminal β- barrel domain [J] J. Biol. Chem.2004，45： 47344-47351
[4] Raja Noor Zaliha Raja Abd Rahman， Lee Poh Geok， Mahiran Basri， et al. An organic solvent- stable alkaline protease from Pseudomonas aeruginosa strain K： Enzyme purification and characterization [J]. Enzyme and Microbial Technology， 2006，7：1484-1491
[5] Mala B.Rao，Aparna M. Tanksale，Mohini S.Ghatge et al. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Protease[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，Sept.1998：597-635
[6] 李鹏，廖智，苗增良，等.1株海洋产电细菌的筛选鉴定及产电条件的优化[J].浙江农业科学，2016，57（9）：1536-1542 [7] [德]B·施特爾马赫著，钱嘉渊译.酶的测定方法[M].北京：中国轻工业出版社，1992：243
[8] 戴玄，唐兵，陈向东等.产高温蛋白酶微生物菌种资源的研究[J].微生物学杂志，1997，17 （3）：25-28
[9] Bond DR，Lovley DR.Electricity production by Geobacter sulfurreducens attached to electrodes[J]. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（3）：1548-1555
[10] WANG Shuai， LIN Xuezheng， HUANG Xiaohang et al， 2012.Screening and characterization of the alkaline protease isolated from PLI-1， a strain of Brevibacillus sp. Collected from Indonesia’s hot springs[J]. Oceanic and Coastal SeaResearch， 11（2）： 213-218
[11] Jasmin C， Sreeja Chellappan， Rajeev K Sukumaran et al， 2010. Molecular cloning and homology modeling of asubtilisin-like serine protease from the marine fungus[J]，Engyodontium album BTMFS10. World J Microbiol Biotechnol， 26： 1269—1279
Production of Alkaline Protease by A Marine Electric Bacteria Strain
LI Peng，MIAO Zengliang，WANG Jianxin
（Marine Science & Technology College，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，China）
Abstract：An electricity-producing strain was obtained from Zhoushan intertidal zone in Zhejiang.16 s rRNA molecule identification，physiological and biochemical experiments showed that the strain belongs to Shewanella and was named Shewanella sp. M2. Strain M2 can produce clear and large hydrolysis transparent circle on the skimmed milk tablet. Its initial protease enzyme activity was 110 U/mL determinated by Folin-phenol method. Ultimately the enzyme activity of mutant strains was 205 U/mL after ultraviolet mutation， Enzyme activity increased by 86.4%. Genetic testing showed that the strain has good genetic stability.
Key words：Alkaline Protease；Folin-phenol method；ultraviolet mutation
（收稿日期：2016-12-14）
关键词：产电菌；蛋白酶；Folin-酚法；紫外诱变
碱性蛋白酶在环保、丝绸、饲料、洗涤剂、食品、医药等领域广泛应用，生产量可以达到酶制剂总产量的40%，经济价值显著[1]。碱性蛋白酶仍然存在品种单一的问题，酶的活性不高，价格昂贵，优质产酶菌株的筛选和选育有着十分重要的应用价值。Kunamneni Adinarayana[2]等发现一种蛋白酶，将其在60 ℃下保温350 min，研究发现该酶仍保持了100%酶活力。Tsuyoshi Nonaka[3]等研究具有抗氧化性能的蛋白酶生产菌，并将其应用于洗涤行业。Raja等[4]利用盐析及层析方法得到的酶，分子量约为51 000 Da，酶活力提高124倍。如今，在极端环境中发现的碱性蛋白酶已经成为研究的热点[5]。
碱性蛋白酶的高产菌株仍旧集中在枯草杆菌属，来源较为单一，导致目前的蛋白酶结构也较为单一。目前海洋来源的蛋白酶逐渐成为研究热点，由于菌株所处环境的原因，可能生产出具有独特酶学性质与结构的蛋白酶。
本实验室在研究微生物燃料电池过程中发现一株海洋产电菌Shewanella sp. M2[6]，初始輸出电压为75 mV，该菌在脱脂奶平板上产生了非常明显的透明圈，通过酶活检测，初始酶活较高，具有很好的选育价值，而产电菌产蛋白酶的报道则很少见，菌株M2具有很好的潜在研究价值。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 培养基 脱脂奶培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠1.0 g，琼脂20.0 g，pH 值72～7.4，加热溶解于1 000 mL海水中，于121 ℃高压灭菌30 min，备用。脱脂牛奶10.0 g，溶于1 000 mL海水中，于115 ℃灭菌30 min。使用前按照1∶1混匀得到培养基。
发酵培养基[7-8]：①酪蛋白10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO4 2.0 g，人工海水1 000 mL，pH 7.5；②可溶性淀粉40 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，蛋白胨15 g，NaCl 5 g，K2HPO4 3.5 g，NaH2PO4 0.3 g，Na2CO3 0.56 g，人工海水 1 000 mL，调pH 7.5；③蛋白胨5.0 g，酵母膏30 g，葡萄糖5.0 g，人工海水 1 000 mL，pH 75；④牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，脱脂奶10.0 g，人工海水1 000 mL，pH 7.5。
产电基础培养基[9]：NaCl 20.0 g， KCl 0.745 g，NaH2PO4 0.35 g， Na2HPO4 0.44 g， MgSO4 0.188 g，Wolfe 微量元素溶液10 mL，陈海水1 L。
1.1.2 试剂 1 000 μg/mL的标准酪氨酸溶液：将酪氨酸放于100～105 ℃的干燥箱中烘干3 h，冷却后，称取0.1 g溶于10 mL 5 mol/L的盐酸中，再用0.1 mol/L的盐酸稀释100 mL，放置于冰箱中保存。
1.1.3 菌种 菌株Shewanella sp. M2，本实验室筛选鉴定后提供，GenBank登录号为KU865683。
1.1.4 产电装置 利用试剂瓶型的微生物燃料电池测试产电量。首先，将目标菌种在产电液体培养基中培养至对数期，冷冻离心，加入阳极室并加入一定量的产电培养基，阴极加入等量产电基础培养基，测量电压。
1.2 实验方法
1.2.1 平板筛选 将纯化后的菌株M2点种于脱脂奶平板上，25 ℃培养，3 d后取出并观察透明圈的产生。
1.2.2 酶活测定 将斜面保种的菌株分别接种于4种发酵培养基，装量为50 mL/250 mL，控制转速80 r/min，2～3 d后测酶活。
1.2.2.1 标准曲线绘制
根据酪氨酸在紫外波长275 nm下具有特征光吸收的原理，利用紫外分光光度法测定酶促反应后在275 nm下的吸光值，得到反应生成的酪氨酸的量，从而计算酶活。按照表1绘制标准曲线。
1.2.2.2 酶活测定
酶活力定义：以酪蛋白为底物，每分钟水解产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。
发酵液5 000 r/ min进行离心，取上清，进行适度稀释后测酶活，实验过程参照表2，试管号1为空白对照。
U=（A×K×4）/（10×N）
其中U表示酶活，A表示吸光值，K为标准曲线的系数，4表示反应总体积，10表示反应时间，N为稀释倍数。
1.2.3 紫外诱变 挑取纯化后的斜面培养物一环接种于发酵培养基中，25 ℃，80 r/min培养3 d，5 000 r/min离心10 min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，制成一定浓度的菌悬液（OD600=0.5±0.15）进行紫外诱变。
紫外灯开启，照射30 min后，取一定量的菌悬液放入6 cm培养皿中，30 cm垂直照射，先盖盖子1 min，后开盖子，同时进行搅拌（可以灭菌后的大头针代替转子），照射时间控制为30、60、90、120、150及180 s。取在各个时间处理的菌液0.1 mL，并用无菌水稀释至10-3浓度，分别在脱脂奶培养基上进行涂布，每个时间点做3个重复，做空白对照，涂布后于暗处培养2～3 d后观察，选取HC比值较大的测酶活。希望获得酶活明显增加的突变菌株。 1.2.4 传代试验及产电试验 将诱变得到的高产菌株进行遗传稳定试验，转接12代，分别测酶活及产电量。
2 结果与分析
2.1 平板试验结果
菌株M2点种于脱脂奶培养基上，3 d后观察结果如图1所示，HC比值为4.3～4.7。
2.2 酶活的测定
2.2.1 标准曲线 用100 μg/mL的酪氨酸标准溶液配制标准系列溶液，以“0”号管为空白对照，不同含量的酪氨酸的吸光度值结果见表3。
吸光值A为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，绘制结果见图2，得到的回归曲线方程为y=0.009 2 x-0.009 1，R2=0.996 8，R2的值大于0.99，显然该方程具有较好的线性相关性。
2.2.2 不同发酵液的酶活测定 绘制标准曲线后，在1-4号发酵培养基中测到的酶活如下表4所示，结果显示可溶性淀粉培养基作为发酵培养基可以获得较高的酶活，酶活达到110 U/mL。
2.3 紫外诱变结果
紫外线诱变结果显示，在紫外照射时间为90～150 s时候具有较好的观察结果，30 s照射时间导致菌落数太多无法很好观察，照射时间达到180 s时则基本没有菌落生长，最终在照射时间为120 s的平板上，测到HC值为5.8的菌落，进行酶活测定，最终酶活为175 U/mL，相比初始酶活，酶活提高了59.1%，提高显著。对M2突变株进行产电试验，获得的输出电压为105 mV，比初始输出电压75 mV提高了40%。
2.4 遗传稳定性试验
将紫外誘变后的菌株进行遗传稳定性试验，结果如表4所示，在连续传代10代，酶活为160 U/mL，酶活减少8.6%，遗传性较为稳定，12代时酶活降低到130 U/mL，酶活降低25.7%，此时产酶稳定性显著降低。输出电压也在12代时降低到70 mV，减少33.3%，输出电压的能力也明显降低。
3 讨论
在舟山潮间带海域中筛选得到一株产电菌Shewanella sp. M2，脱脂奶平板试验显示其具有产蛋白酶能力，在可溶性淀粉发酵培养基得到最大产酶活性，酶活达到110 U/mL，利用紫外线对菌株进行诱变处理，得到诱变株的酶活为175 U/mL，酶活提高为59.1%，输出电压为105 mV，比初始输出电压提高了40%，遗传稳定性试验显示，在传代到10代以后酶活及输出电压才有降低，连续传代10代的遗传稳定性较高。
为了获得更加稳定而高产的突变菌株，目前诱变育种已经与基因工程进行很好的结合。Wang 等[10]从海洋微生物菌株Pseudomonas sp.中发现OFR编码一组无信号肽的氨基酸，在Escherichia coli 成功进行表达。 Jas min等[11]克隆到海洋来源的碱性蛋白酶基因，尝试构建其三维结构。
产电菌多为厌氧菌和兼性厌氧菌，产电菌产蛋白酶的报道很少，这次研究发现对于深入研究产电菌具有很好的价值。
参考文献：
[1]
Gupta R，Beg QK，Lorenz P.Bacterial alkaline proteases： molecular approaches and industrial applications[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2002，59（1）：15-32
[2] Kunamneni Adinarayana，Poluri Elllaiah，Davuluri Siva Prasad et al.Purification and Partial Characterization of Thermostable Serine Alkaline Protease from a Newly Isolated Bacillus sublitis PE-11[J].AAPS PH armSciTech2003；4（4）： 65-72
[3] Tsuyoshi Nonaka， Masahiro Fujihashi， Akiko Kita， Katsuhisa et al. The crystal structure of an oxdatively- stable subtilisin alkaline serine protease， KP-43， with a C-terminal β- barrel domain [J] J. Biol. Chem.2004，45： 47344-47351
[4] Raja Noor Zaliha Raja Abd Rahman， Lee Poh Geok， Mahiran Basri， et al. An organic solvent- stable alkaline protease from Pseudomonas aeruginosa strain K： Enzyme purification and characterization [J]. Enzyme and Microbial Technology， 2006，7：1484-1491
[5] Mala B.Rao，Aparna M. Tanksale，Mohini S.Ghatge et al. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Protease[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，Sept.1998：597-635
[6] 李鹏，廖智，苗增良，等.1株海洋产电细菌的筛选鉴定及产电条件的优化[J].浙江农业科学，2016，57（9）：1536-1542 [7] [德]B·施特爾马赫著，钱嘉渊译.酶的测定方法[M].北京：中国轻工业出版社，1992：243
[8] 戴玄，唐兵，陈向东等.产高温蛋白酶微生物菌种资源的研究[J].微生物学杂志，1997，17 （3）：25-28
[9] Bond DR，Lovley DR.Electricity production by Geobacter sulfurreducens attached to electrodes[J]. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（3）：1548-1555
[10] WANG Shuai， LIN Xuezheng， HUANG Xiaohang et al， 2012.Screening and characterization of the alkaline protease isolated from PLI-1， a strain of Brevibacillus sp. Collected from Indonesia’s hot springs[J]. Oceanic and Coastal SeaResearch， 11（2）： 213-218
[11] Jasmin C， Sreeja Chellappan， Rajeev K Sukumaran et al， 2010. Molecular cloning and homology modeling of asubtilisin-like serine protease from the marine fungus[J]，Engyodontium album BTMFS10. World J Microbiol Biotechnol， 26： 1269—1279
Production of Alkaline Protease by A Marine Electric Bacteria Strain
LI Peng，MIAO Zengliang，WANG Jianxin
（Marine Science & Technology College，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，China）
Abstract：An electricity-producing strain was obtained from Zhoushan intertidal zone in Zhejiang.16 s rRNA molecule identification，physiological and biochemical experiments showed that the strain belongs to Shewanella and was named Shewanella sp. M2. Strain M2 can produce clear and large hydrolysis transparent circle on the skimmed milk tablet. Its initial protease enzyme activity was 110 U/mL determinated by Folin-phenol method. Ultimately the enzyme activity of mutant strains was 205 U/mL after ultraviolet mutation， Enzyme activity increased by 86.4%. Genetic testing showed that the strain has good genetic stability.
Key words：Alkaline Protease；Folin-phenol method；ultraviolet mutation
（收稿日期：2016-12-14）