目的1.通过制备高脱乙酰度低分子量壳聚糖（Chitosan，CS），研制得到壳聚糖纳米微粒（Chitosan nanoparticles，CS-NP）作为具有肝癌靶向作用的药物载体，装载肿瘤内放射治疗药物¹²⁵I-脱氧尿嘧啶核苷酸(¹²⁵I-UdR)后成为具有肿瘤靶向性和缓释性能的¹²⁵I-UdR-壳聚糖纳米微粒(5-[¹²⁵I]Iodo-2’-Deoxyuridine-Chitosan-Nanoparticles，¹²⁵I-UdR-CS-NP)。确定最佳工艺条件并鉴定其理化性质、生物相容性和药物释放特性，分析¹²⁵I-UdR-CS-NP在新西兰兔体内的药代动力学、组织分布和内照射细胞生物学效应。2.分析验证¹²⁵I-UdR-CS-NP对兔肝癌原位模型的被动靶向性，特别是通过肝动脉介入给药方式所能达到的肝癌靶向能力。3.观察分析CS-NP进入肿瘤细胞途径及其在亚细胞水平的分布、转运、降解和药物释放方式。方法1.采用间歇水解法和辐射降解法制备高脱乙酰度低分子量壳聚糖，并分析其红外光谱。2.离子交联法制备CS-NP，并通过正交试验优化其制备工艺。采用激光粒度分析仪、透射电子显微镜和zeta电位仪分析鉴定CS-NP的粒径、分散度、形态和表面性状以及zeta电势等物理性状和表征。3.通过MTT法和流式细胞仪检测肝癌细胞和正常肝组织细胞与CS-NP共同孵育后的存活分数和凋亡率，以评价其生物相容性。4.离子交联法制备¹²⁵I-UdR-CS-NP，并通过单因素分析法确定其最佳工艺条件。测量其粒径、分散度，并用透射电镜观察其形貌。5.采用动态透析法测量¹²⁵I-UdR-CS-NP的体外药物累积释放率，并绘制累积释放曲线，观察比较载药量与释药特性的关系，确认其是否具备长效缓释特性。6.分析外周静脉注射¹²⁵I-UdR-CS-NP后实验兔的药代动力学特性和药物组织分布特征。7.观察分析实验兔注射¹²⁵I-UdR-CS-NP后的血液生化指标和骨髓图片的变化，评价¹²⁵I-UdR-CS-NP在生物体内的毒副作用。8.离子交联法制备异硫氰酸荧光素标记壳聚糖纳米微粒（FITC-CS-NP），并采用激光粒度分析仪、透射电子显微镜和zeta电位仪分析鉴定FITC-CS-NP的粒径、分散度、形态和表面性状以及zeta电势等物理性状和表征。9.体外细胞摄取实验分析肝癌细胞和正常肝组织细胞对¹²⁵I-UdR-CS-NP的摄取量及其时间效应和剂量效应，以验证¹²⁵I-UdR-CS-NP的肝癌靶向性。10.采用激光共聚焦显微镜观察FITC-CS-NP在肝癌细胞和正常肝细胞中不同时段的分布量和位置，验证CS-NP作为药物载体的肝癌靶向性。11.采用ROI区域时间序列扫描技术连续定量分析FITC-CS-NP进入肝癌细胞和正常肝组织细胞的过程。12.采用MTT法、流式细胞仪观察肝癌细胞和正常肝细胞经¹²⁵I-UdR-CS-NP作用后的存活分数和增殖指数。13.用中性单细胞凝胶电泳技术检测肝癌细胞和正常肝细胞经¹²⁵I-UdR-CS-NP作用后2h的DNA链断裂程度和作用后24h的DNA损伤修复能力，以评估¹²⁵I-UdR-CS-NP对肿瘤细胞的杀伤效应。14.超声引导下采用经皮穿刺术在实验兔肝左叶种植VX2瘤块，制备兔肝癌原位模型，并做病理学鉴定。15.兔肝癌原位模型在CT引导下采用Seldinger微导管肝动脉插管术灌注¹²⁵I-UdR-CS-NP，SPECT分时段观察¹²⁵I-UdR-CS-NP在兔体内的分布及其对原位肝癌的靶向性。测量并分析¹²⁵I-UdR-CS-NP在肿瘤和其他组织中的分布，以验证其肿瘤靶向性。16.将用药后48h的肿瘤组织做病理切片后进行Tunel染色，观察细胞凋亡率改变，以评价¹²⁵I-UdR-CS-NP的抑瘤效果。17.激光共聚焦显微镜观察37℃和4℃条件下FITC-CS-NP及其原料FITC-CS长链分子进入肿瘤细胞的行为特征，以观察FITC-CS-NP进入细胞的耗能情况。18.采用CPZ、Fil、Amil分别抑制以clathrin-经典途径、caveolae-途径和巨胞饮三条纳米微粒进入细胞的主要途径后，定量分析¹²⁵I-UdR-CS-NP进入肝癌细胞HepG2的量，以分析其内化途径类型。并用激光共聚焦显微镜观察验证FITC-CS-NP通过不同途径进入肝癌细胞的跨膜过程及其在细胞内的分布特征。19.采用多色荧光染色技术观察FITC-CS-NP在亚细胞水平的动态分布、转运和降解的行为特征。结果1.间歇水解法和辐射降解法制备的壳聚糖脱乙酰度为93.062±2.384%，分子量3kDa，外观为深黄色粉末，在PH=7.0的环境中可完全溶解，呈深黄色澄清透亮的液体。红外图谱表明经碱处理后壳聚糖的酰胺键被水解，更多游离氨基暴露，脱乙酰度得到明显提高。2.成功制备CS-NP，正交试验结果表明，对CS纳米微粒粒径的影响力从大到小依次为CS分子量>TPP浓度>搅拌速度>CS浓度。优化后的制备工艺条件为CS浓度1g/L，搅拌速度600rpm，TPP浓度2g/L，CS分子量3kDa，所制得的CS-NP平均粒径为70.39±5.12nm，PDI0.16±0.012，zeta电位为+32.5±3.3。透射电镜观察其外观为规整的球形，表面平整，大小均匀，分散度较好。3. MTT法和流式细胞仪结果都表明CS-NP对人正常肝细胞株HL-7702、QSG-7701无细胞毒性；当CS-NP浓度≥200μg/mL时对于人肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721有一定的细胞毒性。4.成功制备¹²⁵I-UdR-CS-NP。优化后的制备条件为投药量1.2～2.4mg/mL，PH5.5，所制得的¹²⁵I-UdR-CS-NP平均粒径175.8nm。与空白CS-NP相比，其性状会略有改变，表现为粒径增大且均一性下降，结构较疏松，表面形貌略欠规整。5.¹²⁵I-UdR-CS-NP在PH5.3到7.4环境下的释放曲线符合Higuchi方程，为长效制剂特征，具有明显的缓释作用。6.¹²⁵I-UdR-DLN经外周静脉用药后药代动力学符合二室模型特征，第一时相和第二时相半衰期分别为1.1±0.69h和1.5±0.16h，曲线下面积（AUC0-∞）为11.2±1.4mg/L·h。与¹²⁵I-UdR相比，¹²⁵I-UdR-CS-NP的生物分布倾向于肝脾，通过肾脏的排泄呈现明显的延迟现象，骨髓及胃肠道黏膜的药物分布量较少。7.静脉注射¹²⁵I-UdR-CS-DLN剂量高至7.4MBq（6mg），未发现血液生化指标明显异常，也无明显骨髓抑制现象，而¹²⁵I-UdR对照组2d时骨髓象表明¹²⁵I-UdR对增殖阶段的造血细胞抑制作用较强。表明¹²⁵I-UdR-CS-DLN明显减轻了对骨髓造血细胞的抑制作用。8.体外细胞摄取实验表明¹²⁵I-UdR-CS-NP对上述2株肝癌细胞具有明显的靶向性，进入肝癌细胞的量是正常肝细胞的10倍，并具有时间效应和剂量效应。加药后30min或剂量大于185kBq/mL时细胞内药物的放射性强度都会达到饱和。9.成功制备异硫氰酸荧光素标记的CS-NP（FITC-CS-NP），平均粒径158.02±12.30nm，zeta电势为+28.8±3.1。透射电镜观察外形呈较为规整的球形，表面结构较疏松。10.在细胞摄取实验中，FITC-CS-NP可被上述2株肝癌细胞可大量摄取，且在细胞浆内呈不均匀分布；而FITC-CS-NP进入2株正常肝细胞明显减少，更多的是吸附在细胞膜上，30min后开始解离。11. ROI时序扫描曲线表明FITC-CS-NP与肝癌细胞HepG2接触后完成了细胞膜吸附-跨膜内化-进入细胞浆的过程，细胞膜吸附FITC-CS-NP量的峰值时间为15min，胞浆内FITC-CS-NP荧光峰值时间为30min。FITC-CS-NP同样可以在15min内大量吸附在正常肝细胞HL-7702表面，但随后进入细胞的量很少，且过程明显减慢。12.当浓度≥37kBq/mL时，¹²⁵I-UdR-CS-NP作用后肝癌细胞的存活率明显低于正常肝细胞。流式细胞仪分析细胞周期结果表明，¹²⁵I-UdR-CS-DLN和¹²⁵I-UdR对增殖期的细胞都有杀伤作用，并造成细胞增殖周期阻滞在G1期。而¹²⁵I-UdR-CS-DLN更对DNA合成后进行有丝分裂的G2/M期HepG2细胞也有明显的杀伤作用。13.不论是肝癌细胞HepG2还是正常肝细胞HL-7702，经¹²⁵I-UdR-CS-DLN作用后2h的DNA损伤程度都明显高于同等剂量¹²⁵I-UdR组。药物作用24h后各组的彗星实验结果表明，¹²⁵I-UdR-CS-DLN组的DNA损伤修复能力远低于¹²⁵I-UdR组。另外，¹²⁵I-UdR-CS-DLN组中，肝癌细胞株HepG2的DNA损伤后修复能力明显低于HL-7702。14.成功制备VX2肿瘤兔肝原位模型，均为肝左叶单发肿瘤病灶，平均直径9.2±1.3mm。15. Seldinger微导管经股动脉成功超选择至肝左动脉，灌注¹²⁵I-UdR-CS-NP后，SPECT分时段显像表明¹²⁵I-UdR-CS-DLN凭借Seldinger微导管的精确定位和肝脏首过效应，可大量聚积在肝脏和瘤体内，2h时肝脏组织中的¹²⁵I-UdR-CS-DLN已排泄至全身平均水平，而瘤体内依然有明显的¹²⁵I-UdR-CS-DLN浓聚，到24h时ROI感兴趣区T/NT比值达4.49±1.22。表明¹²⁵I-UdR-CS-DLN在兔体内实验中对肝原位肿瘤有明显的被动靶向性，且具备缓释特征。用药后48h时的药物组织分布表明瘤内放射性强度超过正常肝组织的12倍，是肌肉组织的50倍左右，且表现出更长的药物缓释时间，进一步证明了¹²⁵I-UdR-CS-DLN在兔活体中对肝原位肿瘤的被动靶向性和缓释特征。16.介入给药后48h时肿瘤组织Tunel染色结果表明，¹²⁵I-UdR-CS-DLN可致肿瘤细胞发生明显的凋亡，其肿瘤杀伤能力明显高于同等剂量的¹²⁵I-UdR。17.激光共聚焦显微镜观察结果表明，FITC-CS-NP进入肿瘤细胞主要通过一类温度依赖的，需要消耗细胞能量的主动摄取机制。18.肝癌细胞摄取¹²⁵I-UdR-CS-DLN是多种途径共同参与的，以巨胞饮途径为主（43%），clathrin-经典途径其次（34%），caveolae-途径仅占12%。这三种胞饮机制相互独立，不存在协同作用，但存在一定的代偿作用。激光共聚焦显微镜进一步通过形态和定量手段验证了FITC-CS-NP通过三条胞吞途径进入肝癌细胞的跨膜过程，并观察不同胞吞内体在亚细胞水平的分布规律。19.采用多色荧光染色技术分时段观察结果表明经clathrin-经典途径内吞的FITC-CS-NP跨膜较快，入胞后向细胞核移动并与溶酶体融合，最终次级溶酶体在核周释放出FITC-CS-NP；经巨胞饮途径内吞的FITC-CS-NP入胞较慢，跨膜后散在分布于细胞质中，可驻留较长时间，有利于药物的延迟释放，达到细胞内缓释的目的。结论1.首次将¹²⁵I-UdR装载入纳米药物载体，成为靶向缓释制剂。采用优化工艺条件制备的壳聚糖纳米微粒粒径均匀，形貌规整，生物相容性好；释放曲线符合Higuchi方程，为长效制剂特征，具有明显的缓释作用。2.首次将肝动脉介入给药技术用于提高壳聚糖纳米微粒的被动靶向性。体内外实验证明¹²⁵I-UdR-CS-DLN具有明显的肝癌被动靶向性；经肝动脉介入给药后¹²⁵I-UdR-CS-DLN可大量聚积于肝肿瘤内，48h时瘤内放射性强度是正常肝组织的12倍。同时，¹²⁵I-UdR-CS-DLN在体内外实验中都显示出比¹²⁵I-UdR更强的肿瘤杀伤能力。3.证明¹²⁵I-UdR-CS-DLN主要通过巨胞饮和clathrin-经典途径进入肿瘤细胞，巨胞饮体可在细胞质内实现较长时间驻留；观察并较早证实了通过clathrin-途径进入细胞质的FITC-CS-NP在与溶酶体融合后会导致溶酶体破裂而逃逸。并首次观察到这种逃逸现象集中发生在细胞核周围，这一发现有利于提高药物进入细胞核内的量。总之，本次研制的¹²⁵I-UdR-CS-DLN具有明显的肝癌细胞靶向性和更强的肿瘤杀伤能力，通过肝动脉介入给药可大幅提高其瘤内药物积聚量，在肝癌细胞内可驻留较长时间，并有部分微粒可在核周集中释放。故¹²⁵I-UdR-CS-DLN有望成为肿瘤亚细胞水平内放射治疗的新剂型，达到更好的治疗效果。