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摘要：在农业上以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为有效成分的农药和肥料应用越来越广泛。因此以活菌含量和芽孢率为目的，考察了碳源、氮源、pH、接种量对培养结果的影响。结果表明，采用如下发酵培养基及培养条件：5% 大米粉、2% 豆粕粉、0.05%KH2PO4，0.005%MnSO4， pH6.5-7.5，接种量 1%，培养 48h 时最高活菌含量可达 37.7×108cfu/mL，芽孢率可达 95.4%。此外， 耐盐试验表明，S-2 最高能耐受 6% 的NaCl，耐盐度高，可在盐碱地或高盐的污水处理中应用。
关键词：解淀粉芽孢杆菌，活菌含量，芽孢率，耐盐
Abstract： Bacillus amyloliquefaciens has been widely used as the active ingredient in agricultural pesticides and fertilizers. Therefore， the content of bacteria and spore rate in fermentation broth were used as indexes to investigate the effects of carbon source， nitrogen source， pH and inoculation amount on the culture results. The results showed that the optimal medium for fermentation of Bacillus amyloliquefaciens S-2 was 5% rice flour， 2% soybean meal powder， 0.05%KH2PO4， 0.005%MnSO4， the initial pH of fermentation was 6.5-7.5， and the inoculation amount was 1%.The maximum content of bacteria and spore rate reached 37.7×108cfu/mL and 95.4% when the medium was used for 48h. In addition， salt resistance test results show that S-2 can tolerate the highest 6% NaCl， can be used in saline alkaline land or high salt wastewater treatment.
Key words： Bacillus amyloliquefaciens， content of bacteria， spore rate， salt tolerance
解淀粉芽孢桿菌是一种环境友好的好氧型革兰氏阳性细菌， 菌体呈杆状，产芽孢，并能减免毒理学资料 [1]。该菌分布广泛，在植株、滩涂、海水里都能分离得到。由于该菌能产生多种活性物质（如抗生素、抑菌蛋白、脂肽类等），且对多种植物病原细菌和真 菌（如青枯病、角斑病、枯萎病、根腐病、稻瘟病、纹枯病等）具 有明显的拮抗或抑制作用 [2-4]。因此世界各国的研究者对其在生物防治、促生长、肥料等方面展开了大量的研究工作[5-8]。国内已申 请了解淀粉芽孢杆菌的农药登记证 8 张，有效成分含有解淀粉芽孢杆菌的肥料登记证 1000 多张 [9]。利用从盐碱地植物根际分离得到一株解淀粉芽孢杆菌 S-2，开展了培养特性和发酵条件的优化，为S-2 的应用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
解淀粉芽孢杆菌S-2：分离至盐碱地植物根际土壤，纯化后， 斜面保藏。
1.2 培养基
种子培养基：LB 培养基。发酵培养基：蔗糖 5%，蛋白胨 2%， KH2PO40.05%，MnSO40.005%，pH7.0-7.5。
1.3 方法[10-13]
1.3.1 种子制备
从 S-2 试管斜面中挑取菌苔至 LB 摇瓶中（50mL/250mL）， 于 30℃、150rpm 下培养 18h 后，划线培养，于 30℃培养 24h 后， 取单菌落至LB 摇瓶中30℃、150rpm 下培养18h，得到活化后的S-2， 备用。
1.3.2 盐度对菌体生长影响
以 1.2 中的发酵培养基为对照，通过添加 NaCl 来调节培养基盐度，分别配制 NaCl 含量为 0%、1%、2%、4%、5%、6%、7%、8% 的培养基，按照 1.8% 添加琼脂粉，灭菌后，分别倒培养皿。取 1.3.1 中的种子液，划线培养，观察不同盐度对生长的影响。
1.3.3 活菌含量测定、芽孢含量测定及芽孢率测定方法活菌含量测定方法：稀释涂平板法[14]
芽孢率含量测定：
（1）取培养结束时的发酵液，分装在 250mL 无菌三角烧瓶中， 每瓶30mL，6 瓶，备用。恒温水浴锅（带震荡）设置温度（80±1）℃，待温度稳定后，备用。
（2） 上述 6 个三角烧瓶， 取 3 个常温下震荡 20min， 稀释涂平板测定活菌含量。取平均值 VCK。另外 3 个三角烧瓶，置于80℃的水浴锅中恒温震荡 20min（震荡频率与常温下的对照相同） 后，立马取出，自来水降温至室温后，稀释涂平板检测活菌含量。 取平均值V 处理。
（3） 芽孢率R=V 处理/VCK×100%
1.3.4 培养基组分优化
碳源筛选：以 1.2 中的发酵培养基为基础，分别用 5% 葡萄糖、5% 玉米淀粉、6.5% 大米粉代替 5% 蔗糖，其它成分不变，分装在三角摇瓶中（50mL/250mL），每个摇瓶接种子液 1mL，30℃、150rpm 下培养 48h 后取样测定活菌含量、芽孢率。每个处理 3 次重复，取平均值。 氮源筛选：以优化后的培养基为基础和对照，分别用酵母粉、 花生饼粉、黄豆饼粉、豆粕粉代替蛋白胨。其它条件同上。
1.3.5 培养条件优化
考察初始pH（6、6.5、7、7.5、8）和接种量（0.5%、1%、2%） 对菌株培养的影响。
2 结果与分析
2.1 不同盐度对菌体生长的影响
不同的微生物对环境中盐含量的耐受度不一样，可以利用能 耐高盐含量的微生物在废水处理、盐渍化土壤改良等方面。因此考 察不同盐度对S-2 的生长影响，结果见表 1。
表 1 结果表明，S-2 能够在NaCl 含量不高于 5% 的培养基中生长， 当NaCl 含量为 6% 时，延长培养时间到 96h，也能观察到菌体长出。而 7% 和 8% 的NaCl 平板上，即使延长培养时间到 120h，也无菌 体长出。由此可知S-2 耐盐度高，可以在盐碱地的作物上应用。
2.2 不同碳源对培养结果的影响
不同碳源对S-2 的培养影响结果见图 1。由该结果可知，不同的碳源对 S-2 的培养结果有一定的影响。以葡萄糖为碳源的培养基，接种后，菌体生长迅速，在 36h 时活菌含量达到最高，然后开 20始进入衰退期。由于葡萄糖作为速效碳源，所以消耗速度快，芽孢在 24h 时就开始形成，但在芽孢大量形成时，其活菌含量下降明显。 18综合考虑活菌含量、芽孢率、成本，选择大米粉作为S-2 的碳源。
2.3 不同氮源对培养结果的影响
以大米粉作为碳源，考察不同氮源对 S-2 培养的影响，培养结果见如下图 2。
由该表数据可知，酵母粉、花生饼粉、黄豆饼粉、豆粕粉的 添加有利于芽孢生成时间提前。接种后，CK（氮源为蛋白胨）和 花生餅粉的菌体生长进入对数生长期。而以豆粕粉为氮源，先进入 迟缓期，再快速进入对数生长期，在 48h 时，活菌含量达到最高为37.7×108cfu/mL，芽孢率为 95.4%。综合考虑发酵的活菌含量和芽孢率，选择豆粕粉作为S-2 培养的合适氮源。
2.4 pH 对培养结果的影响
微生物对环境的 pH 比较敏感，合适的 pH 环境有利于菌体的快速生长繁殖。本实验考察了不同的初始 pH 对培养结果的影响。结果见图 3。由该数据可知，初始pH 在 6.5-7.5 之间，发酵后期能保持活菌含量和芽孢率维持在一个比较高的水平。
2.5 接种量对培养结果的影响
接种量的大小不仅涉及到发酵规模放大后生产线的配套建设， 而且对活菌的生长代谢影响较大。考察了 0.5%、1%、2% 的接种量对培养结果的影响，结果见如下图 4。
由该数据可知，3 个接种梯度下，菌体立即进入对数生长期， 并在 12h 时活菌含量相差不大，培养到 24h 时，0.5% 和 2% 接种量的进入缓慢衰退期，而接种量为 1% 的，还在缓慢上升。2% 接种量最先产生芽孢，在 48h 时，1% 接种量的芽孢率要高于 2% 的。因此综合考虑活菌含量和芽孢率，选择 1% 作为S-2 培养的合适接种量。
3 讨论
目前国内外关于解淀粉芽孢杆菌的研究越来越多，特别是在 绿色农业可持续发展的大背景下，国家和农户对环境友好、安全高效的以微生物为有效成分的农药和肥料需求越来越强烈。本实验室筛选到一株对植物病原细菌和病原真菌具有明显抑制作用的细菌——解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）S-2。考察了碳、氮、pH、接种量对培养结果的影响。后续还需进一步将发酵规模逐级放大，以验证和完善发酵工艺，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）S-2 的产业化开发奠定基础。
参考文献
[1]NY/T1109-2017，微生物肥料生物安全通用技术准则
[2] 陈哲，黄静，赵佳，王长彪，梁宏，解淀粉芽孢杆菌抑菌机制的研究进展[J]，生物技术通报，2015，31（6）：37-41
[3] 关晓欢，姜华，解淀粉芽孢杆菌研究进展[J]，生物技术世 界，2013（1）：4，9
[4] 陈士云，杨宝玉，高梅影等，一株抑制油菜核盘菌菌核形成的解淀粉芽孢杆菌，应用与环境生物学报[J]，2005，11（3）： 373-376
[5] 赵晓宇，王佳龙，孟利强等，解淀粉芽孢杆菌发酵技术在生 物防治领域的研究进展 [J]，黑龙江科学，2015，6（4）：18-20
[6] 王英国，王军华，权春善，范圣第，解淀粉芽孢杆菌活 菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究 [J]，中国生物工程杂志， 2007，27（12）：41-45
[7] 杨帆，李新民，刘春来等，解淀粉芽孢杆菌抑菌活性初步研究[J]，黑龙江农业科学，2015（9）：55-59
[8] LIU Wei-wei， MU Wei， ZHU Bing-yu， et al. Antagonistic activities of Volatiles from four strains of Bacillus spp. andPaenibacillus spp. against soil-borne plant pathogens[J].Agricultural Sciences in China， 2008，7（9）：1104-1114
[9] 农业农村部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心（http：//www.biofertilizer95.cn/zhdjcpml）
[10] 刘京兰，薛雅蓉，刘常宏，内生解淀粉芽孢杆菌 CC09 产Iturin A 摇瓶发酵条件优化[J]，微生物学通报，2014，41（1）： 75-82
[11] 魏娇洋，冯龙，李亚宁等，内生解淀粉芽孢杆菌 X-278 发酵条件的优化[J]，北方园艺，2014（05）：106-110
[12] 洪鹏，安国栋，胡美英等，解淀粉芽孢杆菌 HF-01 发酵条件优化[J]，中国生物防治学报，2013，29（4）：569-578
[13] 章小洪，汪琨，朱延恒等，解淀粉芽孢杆菌 BW-13 培养基和培养条件优化 [J]，浙江工业大学学报，2013，41（1）： 35-39
[14] NY/T 2321-2013，微生物肥料产品检验规程
（1. 上海颉赛实业有限公 上海 201101 2. 苏农（广德）生物科技有限公司 安徽 242000）
关键词：解淀粉芽孢杆菌，活菌含量，芽孢率，耐盐
Abstract： Bacillus amyloliquefaciens has been widely used as the active ingredient in agricultural pesticides and fertilizers. Therefore， the content of bacteria and spore rate in fermentation broth were used as indexes to investigate the effects of carbon source， nitrogen source， pH and inoculation amount on the culture results. The results showed that the optimal medium for fermentation of Bacillus amyloliquefaciens S-2 was 5% rice flour， 2% soybean meal powder， 0.05%KH2PO4， 0.005%MnSO4， the initial pH of fermentation was 6.5-7.5， and the inoculation amount was 1%.The maximum content of bacteria and spore rate reached 37.7×108cfu/mL and 95.4% when the medium was used for 48h. In addition， salt resistance test results show that S-2 can tolerate the highest 6% NaCl， can be used in saline alkaline land or high salt wastewater treatment.
Key words： Bacillus amyloliquefaciens， content of bacteria， spore rate， salt tolerance
解淀粉芽孢桿菌是一种环境友好的好氧型革兰氏阳性细菌， 菌体呈杆状，产芽孢，并能减免毒理学资料 [1]。该菌分布广泛，在植株、滩涂、海水里都能分离得到。由于该菌能产生多种活性物质（如抗生素、抑菌蛋白、脂肽类等），且对多种植物病原细菌和真 菌（如青枯病、角斑病、枯萎病、根腐病、稻瘟病、纹枯病等）具 有明显的拮抗或抑制作用 [2-4]。因此世界各国的研究者对其在生物防治、促生长、肥料等方面展开了大量的研究工作[5-8]。国内已申 请了解淀粉芽孢杆菌的农药登记证 8 张，有效成分含有解淀粉芽孢杆菌的肥料登记证 1000 多张 [9]。利用从盐碱地植物根际分离得到一株解淀粉芽孢杆菌 S-2，开展了培养特性和发酵条件的优化，为S-2 的应用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
解淀粉芽孢杆菌S-2：分离至盐碱地植物根际土壤，纯化后， 斜面保藏。
1.2 培养基
种子培养基：LB 培养基。发酵培养基：蔗糖 5%，蛋白胨 2%， KH2PO40.05%，MnSO40.005%，pH7.0-7.5。
1.3 方法[10-13]
1.3.1 种子制备
从 S-2 试管斜面中挑取菌苔至 LB 摇瓶中（50mL/250mL）， 于 30℃、150rpm 下培养 18h 后，划线培养，于 30℃培养 24h 后， 取单菌落至LB 摇瓶中30℃、150rpm 下培养18h，得到活化后的S-2， 备用。
1.3.2 盐度对菌体生长影响
以 1.2 中的发酵培养基为对照，通过添加 NaCl 来调节培养基盐度，分别配制 NaCl 含量为 0%、1%、2%、4%、5%、6%、7%、8% 的培养基，按照 1.8% 添加琼脂粉，灭菌后，分别倒培养皿。取 1.3.1 中的种子液，划线培养，观察不同盐度对生长的影响。
1.3.3 活菌含量测定、芽孢含量测定及芽孢率测定方法活菌含量测定方法：稀释涂平板法[14]
芽孢率含量测定：
（1）取培养结束时的发酵液，分装在 250mL 无菌三角烧瓶中， 每瓶30mL，6 瓶，备用。恒温水浴锅（带震荡）设置温度（80±1）℃，待温度稳定后，备用。
（2） 上述 6 个三角烧瓶， 取 3 个常温下震荡 20min， 稀释涂平板测定活菌含量。取平均值 VCK。另外 3 个三角烧瓶，置于80℃的水浴锅中恒温震荡 20min（震荡频率与常温下的对照相同） 后，立马取出，自来水降温至室温后，稀释涂平板检测活菌含量。 取平均值V 处理。
（3） 芽孢率R=V 处理/VCK×100%
1.3.4 培养基组分优化
碳源筛选：以 1.2 中的发酵培养基为基础，分别用 5% 葡萄糖、5% 玉米淀粉、6.5% 大米粉代替 5% 蔗糖，其它成分不变，分装在三角摇瓶中（50mL/250mL），每个摇瓶接种子液 1mL，30℃、150rpm 下培养 48h 后取样测定活菌含量、芽孢率。每个处理 3 次重复，取平均值。 氮源筛选：以优化后的培养基为基础和对照，分别用酵母粉、 花生饼粉、黄豆饼粉、豆粕粉代替蛋白胨。其它条件同上。
1.3.5 培养条件优化
考察初始pH（6、6.5、7、7.5、8）和接种量（0.5%、1%、2%） 对菌株培养的影响。
2 结果与分析
2.1 不同盐度对菌体生长的影响
不同的微生物对环境中盐含量的耐受度不一样，可以利用能 耐高盐含量的微生物在废水处理、盐渍化土壤改良等方面。因此考 察不同盐度对S-2 的生长影响，结果见表 1。
表 1 结果表明，S-2 能够在NaCl 含量不高于 5% 的培养基中生长， 当NaCl 含量为 6% 时，延长培养时间到 96h，也能观察到菌体长出。而 7% 和 8% 的NaCl 平板上，即使延长培养时间到 120h，也无菌 体长出。由此可知S-2 耐盐度高，可以在盐碱地的作物上应用。
2.2 不同碳源对培养结果的影响
不同碳源对S-2 的培养影响结果见图 1。由该结果可知，不同的碳源对 S-2 的培养结果有一定的影响。以葡萄糖为碳源的培养基，接种后，菌体生长迅速，在 36h 时活菌含量达到最高，然后开 20始进入衰退期。由于葡萄糖作为速效碳源，所以消耗速度快，芽孢在 24h 时就开始形成，但在芽孢大量形成时，其活菌含量下降明显。 18综合考虑活菌含量、芽孢率、成本，选择大米粉作为S-2 的碳源。
2.3 不同氮源对培养结果的影响
以大米粉作为碳源，考察不同氮源对 S-2 培养的影响，培养结果见如下图 2。
由该表数据可知，酵母粉、花生饼粉、黄豆饼粉、豆粕粉的 添加有利于芽孢生成时间提前。接种后，CK（氮源为蛋白胨）和 花生餅粉的菌体生长进入对数生长期。而以豆粕粉为氮源，先进入 迟缓期，再快速进入对数生长期，在 48h 时，活菌含量达到最高为37.7×108cfu/mL，芽孢率为 95.4%。综合考虑发酵的活菌含量和芽孢率，选择豆粕粉作为S-2 培养的合适氮源。
2.4 pH 对培养结果的影响
微生物对环境的 pH 比较敏感，合适的 pH 环境有利于菌体的快速生长繁殖。本实验考察了不同的初始 pH 对培养结果的影响。结果见图 3。由该数据可知，初始pH 在 6.5-7.5 之间，发酵后期能保持活菌含量和芽孢率维持在一个比较高的水平。
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接种量的大小不仅涉及到发酵规模放大后生产线的配套建设， 而且对活菌的生长代谢影响较大。考察了 0.5%、1%、2% 的接种量对培养结果的影响，结果见如下图 4。
由该数据可知，3 个接种梯度下，菌体立即进入对数生长期， 并在 12h 时活菌含量相差不大，培养到 24h 时，0.5% 和 2% 接种量的进入缓慢衰退期，而接种量为 1% 的，还在缓慢上升。2% 接种量最先产生芽孢，在 48h 时，1% 接种量的芽孢率要高于 2% 的。因此综合考虑活菌含量和芽孢率，选择 1% 作为S-2 培养的合适接种量。
3 讨论
目前国内外关于解淀粉芽孢杆菌的研究越来越多，特别是在 绿色农业可持续发展的大背景下，国家和农户对环境友好、安全高效的以微生物为有效成分的农药和肥料需求越来越强烈。本实验室筛选到一株对植物病原细菌和病原真菌具有明显抑制作用的细菌——解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）S-2。考察了碳、氮、pH、接种量对培养结果的影响。后续还需进一步将发酵规模逐级放大，以验证和完善发酵工艺，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）S-2 的产业化开发奠定基础。
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[14] NY/T 2321-2013，微生物肥料产品检验规程
（1. 上海颉赛实业有限公 上海 201101 2. 苏农（广德）生物科技有限公司 安徽 242000）